一种水稻雌性核不育基因工程表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种水稻雌性核不育基因工程表达载体及其应用，属农业生物技术领域。为了实现水稻雌性核不育系的种子和幼苗的繁殖，本发明专利技术提供了一种通过转基因“中转”删除的技术手段实现非转基因的纯合雌性核不育系繁殖的目的。具体地，遗传工程雌性核不育系即杂合型转基因T0株系自交结实后获得转基因T1分离群体，在转基因T1分离群体的幼苗期通过喷施苯达松除草剂致死筛除转基因的雌性育性恢复的植株，存活的T1植株即为非转基因的雌性核不育(fst/fst)植株。非转基因的雌性核不育系可满足于“FS+MS(FM

【技术实现步骤摘要】
一种水稻雌性核不育基因工程表达载体及其应用


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种基于水稻FST和CYP81A6基因构建的用于繁殖水稻雌性核不育系的基因工程水稻表达载体及其应用于水稻雌性核不育系繁殖的方法。
技术背景
[0002]中国作为世界上第一个发展并推广杂交水稻的国家，从1964年开始对水稻雄性不育的研究(袁隆平.水稻的雄性不孕性.科学通报,1966,17:185
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188)，到1973年实现的水稻雄性不育系、保持系和恢复系的“三系配套”成功，并在1975年就建立了较完善的杂交水稻制种技术体系并开始推广应用(任光俊,颜龙安,谢华安.三系杂交水稻育种研究的回顾与展望.科学通报,2016,61:3748
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3760)。“三系法”(3
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line system)杂交水稻技术体系的完善打破了水稻作为自花授粉作物杂种优势利用的技术壁垒，实现了水稻杂种优势的利用。“三系法”杂交水稻技术体系是基于核质互作雄性不育系为母本、以保持系为父本来繁殖雄性不育系的种子，再用不育系为母本、以恢复系为父本大规模生产具有杂种优势的杂交种子。但是，“三系法”杂交水稻技术体系受到恢保关系的制约，不育系资源较少，优良保持系选育比较困难，对水稻丰富的种质资源利用的范围有限。
[0003]水稻杂种优势利用的另外一个重要技术途径就是“两系法”(2
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line system)杂交水稻技术体系，是基于受自然光周期、温度调控的光温敏雄性核不育系建立起来的(牟同敏.中国两系法杂交水稻研究进展和展望.科学通报,2016,61:3761
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3769)。水稻光温敏雄性核不育系的育性转换是受到幼穗分化期环境光温调控的孢子体隐性核基因控制的。因此，光温敏雄性核不育系可以一系两用，不仅简化了杂交种子的生产程序，而且组配自由，不受恢保关系的制约，拓宽了资源利用的范围。但是，基于光温敏雄性核不育系的两系法杂交制种和繁殖都受到了时空条件的限制，其临界不育温度会发生漂移，其制种存在不可控的潜在风险。
[0004]核质互作雄性不育系和光温敏雄性核不育系的利用，使得水稻杂种优势的利用在实际生产中取得了巨大成功，但是除了各自存在的缺陷以外，都面临着杂交种子制种效率低、不能大面积机械化操作的问题。因此，引入新的育种技术，开发出资源利用率高、杂交制种安全、高效的水稻杂种优势利用的育种新技术是杂交水稻发展的方向，分子设计育种为杂交水稻育种开拓出了新的途径(邓兴旺,王海洋,唐晓艳,等.杂交水稻育种将迎来新时代.中国科学:生命科学,2013,43:864
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868)。
[0005]隐性雄性核不育系的不育性稳定，用于杂交制种安全可靠，有利于开展大面积的机械化的杂交制种。然而，由于隐性雄性核不育系的不育性由核基因控制，不育系种子的批量繁殖是限制其运用于育种实践中的实质问题。2006年,美国杜邦先锋公司率先在玉米中实现了基于雄性核不育突变材料的种子生产技术,并命名为Seed production technology(SPT)技术。该技术的基本原理是将花粉育性恢复基因、花粉失活(败育)基因和标记筛选基因作为紧密连锁的元件导入隐性雄性核不育突变体中，获得雄性核不育突变体的保持材料
用于生产制种。“智能不育杂交育种技术”，也称“第三代杂交水稻技术”证实了隐性水稻雄性核不育基因在杂交水稻育种中利用的可能性。邓兴旺等人利用一个雄性核不育基因OsNP1连锁花粉失活基因和红色荧光标记基因，构建了一个水稻智能雄性核不育系。水稻智能雄性核不育系的自交种子基于连锁的转基因红色荧光进行色选，可以将含有转基因成分的雄性可育种子和不含转基因成分的纯合雄性核不育种子进行转基因红色荧光分选，并进一步用于杂交种的生产(Chang Z.et al.Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene.Proc Natl Acad Sci USA，2016，113,14145
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14150)。
[0006]无论是基于SPT技术策略利用隐性雄性核不育基因的第三代杂交育种技术和多控不育系统(Multi
‑
Control Sterility System，MCS)(An,X.L.,Dong,Z.Y.,Tian,Y.H.,et al.ZmMs30 Encoding a Novel GDSL Lipase Is Essential for Male Fertility and Valuable for Hybrid Breeding in Maize.Mol.Plant,2019,12,343
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359)，或是通过挖掘利用显性核不育基因的显性雄性核不育(Dominant Male
‑
Sterility，DMS)系统的新技术策略(An,X.L.,Ma,B.,Duan,M.J.,Dong,et al.Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male
‑
sterility system in multiple species.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2020,117,23499
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23509)，都可以将自然界广泛存在的水稻雄性核不育基因成功应用于杂种优势利用当中，也为创制新型杂交水稻技术体系提供了最广泛和最理想的花粉受体材料，为组配筛选更多的优势组合提供的更大的可能。当然，基因工程雄性核不育系创制的各种策略也为水稻雌性核不育(Female Sterile,FS)基因的利用提供了最直接的参考，通过借鉴遗传工程雄性核不育系创制的方法策略，遗传工程雌性核不育系也实现了雌性不育系的种子繁殖(Xia,Y.M.,Tang,N.,Hu,Y.Y.,et al.Amethod for mechanized hybrid rice seed production using female sterile rice.Rice,2019,12,39)，这为突破杂交水稻制种技术体系的产业化应用的技术瓶颈，实现雌性育性基因FST(FEMALE
‑
STERILE)(雌性育性基因FST为雌性核不育基因fst的野生型基因)调控的雌性核不育系的种子繁殖提供了可行的技术思路，为“FS+MS(FM
‑
line)”(雄性不育，Male Sterile，MS)杂交水稻制种技术新体系创建和应用实践的可行性提供了理论支撑(陈丽娟，李东宣，李成云，谭学林，徐学洙，朱有勇.雌性不育基因FST用于杂交水稻育种的方法[P].中国专利：CN101658129B,2012
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻雌性核不育基因工程表达载体(pFST::FST//p35S::BTZ
‑
RNAi)，其特征在于，包括用于转基因水稻雌性育性互补的FST基因表达元件(FST
T
)和用于转基因筛除的苯达松敏感致死的水稻CYP81A6基因的功能性RNAi元件(p35S::BTZ
‑
RNAi)。2.如权利要求1所述的水稻雌性核不育基因工程表达载体(pFST::FST//p35S::BTZ
‑
RNAi)，其特征在于，所述用于转基因水稻雌性育性互补的FST基因表达元件(FST
T
)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述用于转基因筛除的苯达松敏感致死的水稻CYP81A6基因的功能性RNAi元件(p35S::BTZ
‑
RNAi)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种纯合的非转基因水稻雌性核不育系的繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1或2所述的水稻雌性核不育基因工程表达载体(pFST::FST//p35S::BTZ
‑
RNAi...

【专利技术属性】
技术研发人员：李东宣，陈丽娟，李伟，朱骞，郭效琼，吴文斌，余卫霖，李仕川，罗迪，王天杰，王春丽，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：