腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及病毒的分离纯化领域，具体涉及一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法。该方法包括以下步骤：将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性后过滤，之后采用肝素亲和层析和凝胶过滤层析两步层析法即可达到rAAV9的分离纯化目的，分离后的rAAV9纯度能够达到95％以上，回收率至少能够达到78％以上，当采用汇研生物Heparin Focurose 6FF作为第一步的纯化介质进行纯化时，其收率能达到96％以上。其收率能达到96％以上。

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法


[0001]本专利技术涉及病毒的分离纯化领域，具体涉及一种腺相关病毒的分离纯化方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用，cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞，rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。
[0003]重组腺相关病毒载体(rAAV)是由野生型腺相关病毒(AAV)改造而来，rAAV基因组仅包含AAV两端的末端重复序列(ITR)，所含外源基因完全替代了病毒自身编码基因。通过在包装细胞系中反式补偿AAV的复制基因Rep、结构基因Cap和包装辅助基因可制备获得rAAV。
[0004]重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
>[0005]目前已注册的AAV种类总数已超过196种，灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV(即AAV1
‑
AAV13)，其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身，不同的rAAV亚型对人体组织有不同的亲和性，而且每个亚型的rAAV其分离纯化方法也是不同的。rAAV9对心脏，肌肉，肺(肺泡)，肝脏及中枢神经有较好的亲和性，且其特殊之处在于rAAV9可穿过血脑屏障。但是目前国内关于纯化rAAV9的研究并不多，且其存在着纯化过程繁琐、杂蛋白含量较多、纯度低、回收率低的问题。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于提供一种rAAV9的分离纯化方法。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0008]将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性，过滤；
[0009]肝素亲和层析：采用带有肝素的层析介质对过滤后的液相组合物进行亲和层析，收集流穿液并浓缩；
[0010]凝胶过滤层析：将浓缩后的流穿液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，即得。
[0011]作为本专利技术的一种实施方式，肝素亲和层析的填料为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm。
[0012]作为本专利技术的一种实施方式，所述层析介质为汇研生物Heparin Focurose 6FF。
[0013]作为本专利技术的一种实施方式，亲和层析所用的平衡液为8～12mM PB，pH 7.0。
[0014]作为本专利技术的一种实施方式，亲和层析所用的洗脱液为8～12mM PB，2.0M NaCl，pH 7.0。
[0015]作为本专利技术的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的填料为高度交联的琼脂糖和葡聚糖，或高度交联4％的琼脂糖。
[0016]作为本专利技术的一种实施方式，凝胶过滤层析所用的平衡液和缓冲液为15～25mM PB，0.1～0.2M NaCl，pH7.0。
[0017]作为本专利技术的一种实施方式，液相组合物采用0.45μm的膜过滤。
[0018]作为本专利技术的一种实施方式，所述液相组合物为细胞裂解液或细胞培养上清液。
[0019]本专利技术所提供的腺相关病毒rAAV9纯化方法能够很好的分离纯化rAAV9，分离后的rAAV9纯度能够达到95％以上，回收率至少能够达到78％以上，当采用汇研生物Heparin Focurose 6FF作为第一步的纯化介质进行纯化时，其收率能达到96％以上。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例1中亲和层析后的纯化图谱，其中L1为流穿1，L2为流穿2，L3为流穿3，L4为流穿4，E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4；
[0021]图2为本专利技术实施例1中亲和层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为全液(未离心过滤)，泳道2为原液(离心过滤后)，泳道3为流穿1，泳道4为流穿2，泳道5为流穿2浓缩液，泳道6为流穿3，泳道7为流穿3浓缩液，泳道8为流穿4，泳道9流穿4浓缩液，泳道10为洗脱1，泳道11为洗脱2，泳道12为洗脱3，泳道13为洗脱4；
[0022]图3为本专利技术实施例1中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4，E5为洗脱5，E6为洗脱6，E7为洗脱7；
[0023]图4为本专利技术实施例1中凝胶过滤层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为洗脱1浓缩液，泳道2为洗脱2浓缩液，泳道3为洗脱3浓缩液，泳道4为洗脱4，泳道5为洗脱5，泳道6为洗脱6，泳道7为洗脱7；
[0024]图5为本专利技术实施例2中凝胶过滤层析后的纯化图谱，其中E1为洗脱1，E2为洗脱2，E3为洗脱3，E4为洗脱4；
[0025]图6为本专利技术实施例2中凝胶过滤层析后的电泳图，其中Mr为marker，泳道1为原液，泳道2为原液浓缩滤出液，泳道3为洗脱1浓缩液，泳道4为洗脱2浓缩液，泳道5为洗脱3浓缩液，泳道6为洗脱4。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0027]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供一种腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0030](1)收集含有rAAV9的sf9昆虫细胞上清液，将上清液用纯化水稀释4倍左右，调节pH至7.0后，0.45μm膜过滤；
[0031](2)肝素亲和层析：采用Heparin Focurose 6FF(汇研生物，介质为高度交联6％的琼脂糖，其粒径范围为45～165μm，平均粒径约为90μm)作为层析柱，用10mM PB，pH7.0的平衡液平衡10个柱体积以上，流速为60cm/h；
[0032]将处理后的昆虫细胞上清液以30cm/h的流速进行上样，根据病毒滴度一般上样20个柱体积，流速为30cm/h，收集流穿峰；上样结束后以平衡液清洗层析柱20个柱体积，流速为60cm/h；采用盐浓度线性梯度洗脱的方式，盐溶液由0M NaCl(0％B)在15个柱体积时间内线性逐步上升至2M NaCl(100％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含rAAV9的液相组合物，调节pH至中性，过滤；肝素亲和层析：采用带有肝素的层析介质对过滤后的液相组合物进行亲和层析，收集流穿液并浓缩；凝胶过滤层析：将浓缩后的流穿液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，即得。2.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，肝素亲和层析的填料为高度交联6％的琼脂糖。3.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，所述层析介质为汇研生物Heparin Focurose 6FF。4.根据权利要求1所述的腺相关病毒rAAV9的分离纯化方法，其特征在于，亲和层析所用的平衡液为8～12mM PB，pH 7.0。5.根据权利要求1所述的腺相...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖胜杰，皮妮，曾凡星，吴阳，
申请(专利权)人：武汉汇研生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：