癫痫动物模型的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了难治性癫痫动物模型的制备及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种非人哺乳动物的难治性癫痫动物模型的制备方法，其中所述制备方法包括以下步骤：(1)提供一非人哺乳动物A和同一物种的神经元细胞特异性Cre重组酶表达的非人哺乳动物B；其中所述的非人哺乳动物A的基因组具有：(E1)内源的Cdkl5基因，和(E2)与Cdkl5基因操作性连接的并用于条件敲除Cdkl5基因的条件敲除元件，其中，所述的条件敲除元件在所述的Cre重组酶存在下，条件敲除神经元细胞的基因组的Cdkl5基因，从而使得Cdkl5基因失活；(2)将所述的动物A与动物B交配繁育，获得Cdkl5基因在神经元细胞特异性敲除的子代非人哺乳动物C；(3)培养所述的子代非人哺乳动物C，从而得到所述的难治性癫痫动物模型，本发明专利技术还可根据动物的自发癫痫表型的变化，初步评价抗癫痫药物的疗效。价抗癫痫药物的疗效。

【技术实现步骤摘要】
癫痫动物模型的制备及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地涉及癫痫动物模型的制备及其应用。

技术介绍

[0002]癫痫是由神经元同步异常放电引起的，会导致短暂的大脑功能障碍。
[0003]为了更好地理解CDKL5综合症相关的癫痫发病机制，研究人员建立了多个转基因小鼠模型，这些模型鼠表现出了许多行为学异常，包括后肢抱团、活动量改变、眼球追踪异常、学习记忆受损以及自闭症样社交障碍等表型。但遗憾的是，这些模型小鼠均无自发性癫痫的发生。并且因此目前缺乏模拟CDKL5综合症患者难治性癫痫的动物模型。
[0004]并且目前临床上还没有治疗癫痫的有效药物，尤其是对该病的婴幼儿早发性癫痫症状，传统抗癫痫药疗效较差。并且在该领域由于缺乏可靠的动物模型进行体内药物筛选，因此大大降低了治疗该疾病药物开发的效率。
[0005]因此本领域迫切需要开发可大大提高药物研发效率和准确性，降低临床研究失败的风险的筛药动物模型。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种大大提高药物研发效率和准确性，降低临床研究失败的风险的筛药动物模型。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种非人哺乳动物的难治性癫痫动物模型的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)提供一非人哺乳动物A和同一物种的神经元细胞特异性Cre重组酶表达的非人哺乳动物B；
[0009]其中所述的非人哺乳动物A的基因组具有：(E1)内源的Cdkl5基因，和(E2)与Cdkl5基因操作性连接的并用于条件敲除Cdkl5基因的条件敲除元件，其中，所述的条件敲除元件在所述的Cre重组酶存在下，条件敲除神经元细胞的基因组的Cdkl5基因，从而使得Cdkl5基因失活；
[0010](2)将所述的动物A与动物B交配繁育，获得CDKL5基因在神经元细胞特异性敲除的子代非人哺乳动物C；
[0011](3)培养所述的子代的非人哺乳动物C，从而得到所述的难治性癫痫动物模型。
[0012]在另一优选例中，所述的难治性癫痫动物模型具有如下特征：特征性的难治性癫痫脑电波。
[0013]在另一优选例中，本专利技术所述的癫痫脑电波具有高振幅和高频率的特点，通过EEG记录分析，容易与未发作期的低振幅的脑波区分，也可以与小鼠偶然痉挛时产生的单次高振幅脑波区分，该特征更有利于判断癫痫鼠模型癫痫发作的频率。
[0014]在另一优选例中，所述的难治性癫痫动物模型具有如下一种或多种特征：
[0015]单次癫痫发作的持续时间在30-90秒；
[0016]每天的发作次数在0-35次，随着癫痫的进展，发作次数逐渐增加；
[0017]本专利技术的动物模型相较于以往癫痫模型具有的特征是自发的，而且是高频的。
[0018]在另一优选例中，所述的非人哺乳动物A为雌性，并且两个X染色体上均具有所述的内源CDKL5基因和所述条件敲除元件，即所述非人哺乳动物A为纯合的雌性动物。
[0019]在另一优选例中，当所述的非人哺乳动物A为雌性时，所述的子代非人哺乳动物C为第一代子代动物，且所述子代动物为雄性。
[0020]在另一优选例中，所述的非人哺乳动物A为雄性，并且一个X染色体上具有所述的内源CDKL5基因和所述条件敲除元件。
[0021]在另一优选例中，当所述的非人哺乳动物A为雄性时，所述的子代非人哺乳动物C为第二代子代动物，且所述第二代子代动物为雄性或雌性。
[0022]在另一优选例中，根据孟德尔遗传定律，用来繁殖子代非人哺乳动物C的亲代动物A和动物B均可以是任意雌性和雄性的组合，在产生的后代中(第一代及以上后代)，通过基因型鉴定选出具有自发癫痫表型的条件性敲除鼠。
[0023]在另一优选例中，所述难治性癫痫包括自发的难治性癫痫、婴幼儿早发性癫痫、CDKL5综合症癫痫。
[0024]在另一优选例中，所述的神经元细胞包括：兴奋性神经元细胞。
[0025]在另一优选例中，所述的条件敲除神经元细胞的基因组的CDKL5基因包括部分或全部敲除CDKL5基因。
[0026]在另一优选例中，所述的条件敲除元件包括loxp序列。
[0027]在另一优选例中，所述动物A基因组的CDKL5基因中的一个或多个外显子的两侧插入有loxp序列。
[0028]在另一优选例中，所述动物A的CDKL5基因中的6号外显子的两侧插入有loxp序列。
[0029]在另一优选例中，所述的loxp序列之间还插入有筛选标记。
[0030]在另一优选例中，所述筛选标记为neo基因。
[0031]在另一优选例中，所述动物B的基因组中包含一外源Cre表达盒。
[0032]在另一优选例中，所述的外源Cre表达盒包括：(a)神经元细胞特异性启动子；和(b)位于所述神经元细胞特异性启动子下游的Cre基因。
[0033]在另一优选例中，所述Cre基因包括Cre重组酶或改进的Cre重组酶(improved Cre，iCre)的基因。
[0034]在另一优选例中，所述的神经元细胞特异性启动子包括Emx1基因或CamK2α基因的启动子。
[0035]在另一优选例中，所述的动物C的CDKL5基因从特定的时间点(Emx1-Cre从胚胎12.5天，CamK2α-iCre从出生后)开始在神经元细胞中特异性敲除。
[0036]在另一优选例中，所述敲除包括CDKL5基因不表达，或表达没有活性的CDKL5蛋白，或表达致病性突变的CDKL5基因。
[0037]在另一优选例中，所述特异性敲除是通过敲除CDKL5基因的6号外显子实现的。
[0038]在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。
[0039]在另一优选例中，与同窝对照或野生型对照动物相比，所述的难治性癫痫动物模
型具有以下一个或多个特征：
[0040](a)根据Racine癫痫分级标准，癫痫由低级向高级发展；
[0041](b)颗粒细胞轴突纤维在齿状回内分子层呈带状分布；
[0042](c)癫痫发作频率增加；
[0043](d)癫痫最终导致动物死亡；
[0044](e)产生了特征性的癫痫脑电波；
[0045](f)出现典型的癫痫大发作的行为；
[0046](g)出现大脑的癫痫样放电。
[0047]本专利技术第二方面提供了一种本专利技术第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，所述的模型用于研究难治性癫痫发病机制的动物模型。
[0048]在另一优选例中，所述难治性癫痫包括自发的难治性癫痫、婴幼儿早发性癫痫、CDKL5综合症癫痫。
[0049]本专利技术第三方面提供了一种本专利技术第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，将该模型被用于筛选或鉴定可减轻或治疗难治性癫痫的物质(治疗剂)。
[0050]本专利技术第四方面提供了一种筛选或鉴定治疗或缓解难治性癫痫的潜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非人哺乳动物的难治性癫痫动物模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供一非人哺乳动物A和同一物种的神经元细胞特异性Cre重组酶表达的非人哺乳动物B；其中所述的非人哺乳动物A的基因组具有：(E1)内源的Cdkl5基因，和(E2)与Cdkl5基因操作性连接的并用于条件敲除Cdkl5基因的条件敲除元件，其中，所述的条件敲除元件在所述的Cre重组酶存在下，条件敲除神经元细胞的基因组的Cdkl5基因，从而使得Cdkl5基因失活；(2)将所述的动物A与动物B交配繁育，获得CDKL5基因在神经元细胞特异性敲除的子代非人哺乳动物C；(3)培养所述的子代的非人哺乳动物C，从而得到所述的难治性癫痫动物模型。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的难治性癫痫动物模型具有如下特征：特征性的难治性癫痫脑电波。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的难治性癫痫动物模型具有如下一种或多种特征：单次癫痫发作的持续时间在30-90秒；每天的发作次数在0-35次，随着癫痫的进展，发作次数逐渐增加；本发明的动物模型相较于以往癫痫模型具有的特征是自发的，而且是高频的。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述难治性癫痫包括自发的难治性癫痫、婴幼儿早发性癫痫、CDKL5综合症癫痫。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的神经元细胞包括：兴奋性神经元细胞。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，与同窝对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊志奇，王红涛，程学文，朱姊艾，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：