一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途技术

本发明专利技术创造提供了一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途，所述融合蛋白酶包括蛋白酶7片段mmp7C和/或蛋白酶9片段mmp9C；所述蛋白酶7片段mmp7C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白酶9片段mmp9C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的融合蛋白酶在提取动物皮和肌腱组织的I型胶原蛋白的过程中，I型胶原蛋白空间结构不会被破坏，且能够去除终产品中的杂蛋白，提高了I型胶原蛋白的提取率。提高了I型胶原蛋白的提取率。提高了I型胶原蛋白的提取率。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途


[0001]本专利技术创造属于生物基因工程
，尤其是涉及一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，再到组织分布和功能等，具有显著的多样性。它们存在于生物的各种组织中，如，皮肤、骨、肌腱、基底膜等等。I型胶原蛋白较多地存在于骨骼和肌腱中。其分子长度约300nm，直径约1.5nm，呈棒状。显微结构上I型胶原蛋白由三条肽链组成，包括两条α(I)链和一条 α(II)链。由于I型胶原蛋白具有可降解性、生物相容性和止血性等许多生物优点，因此被作为天然生物材料被广泛应用在生物医药和化妆品中。
[0003]目前市场上出售的I型胶原蛋白主要是从动物的皮和肌腱组织中提取制备而成，由于现有的提取方法制备出的I型胶原蛋白受工艺条件的影响，提取产率较低，而且提取的胶原蛋白中含有的杂蛋白较多，严重影响胶原蛋白的质量。酸法：酸溶液无法溶解交联程度较大的胶原蛋白，而这种胶原蛋白所占的比例又较高，提取率不高，且杂蛋白无法去除。碱法：碱法提取使得胶原蛋白会被降解成多肽，提取周期较长，由于易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸，还会产生 D、L
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型氨基酸消旋混合物，有些D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。酶法：市场上常用水解鼠尾肌腱的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、凤梨蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶，这些蛋白酶在降解杂蛋白的同时，也将I型胶原蛋白降解，使I型胶原蛋白失去空间结构。酸酶法：常用的酸为弱酸，常用的酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶、凤梨蛋白酶。虽然酸酶法比酸法、碱法、酶法的提取效率都要高，但是酸酶法中的酶在降解杂蛋白的同时，也会降解I型胶原蛋白，破坏I型胶原蛋白的空间结构。
[0004]因此开发一种只对杂蛋白进行水解，而对I型胶原蛋白无影响的蛋白酶，来提取I型胶原蛋白的方法，以保护I型胶原蛋白空间结构不被破坏，且去除终产品中的杂蛋白，来满足I型胶原蛋白在生物医学和化妆品行业等领域的应用显得十分重要。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种融合蛋白酶，以解决现有技术中的蛋白酶在提取制备I型胶原蛋白的过程中，在降解杂蛋白的同时，也将I型胶原蛋白降解，使I型胶原蛋白失去空间结构的技术问题。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种融合蛋白酶，所述融合蛋白酶包括蛋白酶7片段mmp7C和/或蛋白酶9片段mmp9C；
所述蛋白酶7片段mmp7C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白酶9片段mmp9C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]优选的，所述融合蛋白酶从N端至C端的连接顺序为蛋白酶7片段mmp7C、连接肽linker、蛋白酶9片段mmp9C；所述连接肽linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术在提供上述融合蛋白酶的同时，还提供了编码上述融合蛋白酶的核苷酸序列。
[0009]优选的，编码本专利技术融合蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
[0010]本专利技术还提供了含有上述编码本专利技术融合蛋白酶的核苷酸序列的克隆载体。
[0011]优选地，所述克隆载体包括pET21a。
[0012]本专利技术还提供了含有上述编码本专利技术融合蛋白酶的核苷酸序列或克隆载体的工程菌。
[0013]优选地，所述工程菌为含有pET21a的大肠杆菌BL21。
[0014]本专利技术还提供了上述融合蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：（1）将融合蛋白酶的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET21a的NdeI和HindIII酶切位点之间，构建重组大肠杆菌表达载体；（2）将步骤（1）构建的重组大肠杆菌表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，细胞裂解液破碎细胞，离心收集上清；（3）将步骤（2）收集的上清通过Ni
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柱纯化，即得到融合蛋白酶。
[0015]本专利技术还提供了上述融合蛋白酶在提取I型胶原蛋白中的应用。
[0016]优选的，上述融合蛋白酶在提取鼠尾肌腱中的I型胶原蛋白中的应用。
[0017]相对于现有技术，本专利技术创造具有以下优势：（1）应用本专利技术所述的融合蛋白酶在提取动物皮和肌腱组织的I型胶原蛋白的过程中，I型胶原蛋白空间结构不会被破坏，且能够去除终产品中的杂蛋白，提高了I型胶原蛋白的提取率。
[0018]（2）使用本专利技术的融合蛋白酶提取的I型胶原蛋白具有优良的生物相容性和生物活性，能够适应生物医学的应用，同时能够活化上皮细胞，促进上皮细胞增生和胶原酶生成，使皮肤紧致有弹力，具有保湿、防皱、亮肤等特性，在化妆品领域具有重要的应用价值。
[0019]（3）使用本专利技术的融合蛋白酶提取的I型胶原蛋白具有修复的特性，可以在软骨损失的治疗中使用；具有止血的特性，可以作为止血剂中原料的添加；具有护理的特性，可以作为烧伤和创伤修复材料中原料的添加。
附图说明
[0020]图1为重组质粒pET21a
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mmp7c的图谱；图2为重组质粒pET21a
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mmp9c的图谱；图3为重组质粒pET21a
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mmp7c
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linker
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mmp9c的图谱；图4为重组质粒pET21a
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mmp7c的PCR鉴定结果；图5为重组质粒pET21a
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mmp9c的PCR鉴定结果；图6为重组质粒pET21a
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mmp7c
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linker
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mmp9c的PCR鉴定结果；
图7为羟脯氨酸的标准曲线；图8为吸湿度检测对比图。
具体实施方式
[0021]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]下面结合实施例来详细说明本专利技术创造。
[0023]实施例中使用的实验材料如下：1、菌株和质粒：BL21/pET21a2、试剂：质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶、NdeI、EcoRI、HindIII、DNA Ladder Marker、IPTG、LB培养基。
[0024]3、主要溶液：3.1、基因克隆a) 核酸电泳缓冲液 (50
×
TAE)b) EB储备液(10 mg/mL)：100mg EB，10mL蒸馏水，充分搅拌溶解，4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白酶，其特征在于：所述融合蛋白酶包括通过连接肽连接的蛋白酶7片段和蛋白酶9片段，所述融合蛋白酶从N端至C端的连接顺序为蛋白酶7片段、连接肽、蛋白酶9片段；所述蛋白酶7片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白酶9片段mmp9C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.编码权利要求1所述的融合蛋白酶的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。3.含有权利要求2所述的核苷酸序列的重组质粒。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括pET21a。5.含有如权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求4所述的重组表达载体的重组工程菌。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，许洋，
申请(专利权)人：天津辅元生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：