芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用，该表达载体以pTC、pTN、pBE、pTK为出发载体将不同的启动子PlacI

【技术实现步骤摘要】
芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，它可以进行厌氧繁殖，生成抗逆性孢子，广泛的存在于环境中。芽孢杆菌具有抗酸碱能力强、耐高温、耐高压、耐氧化、快速复活和较强分泌酶等特点，且分泌系统完善，能直接将许多蛋白分泌到培养基中；但它们同时会分泌一些蛋白酶，具有很强的蛋白降解活性，会降低外源蛋白的表达效率。
[0003]芽孢杆菌中大多数可以作为表达宿主，主要包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌是目前使用最多的表达宿主。芽孢杆菌细孢只有一层膜结构，可以直接将细孢外酶分泌到培养基中，无需细孢破碎，无孢内蛋白污染，利于后续分离纯化，且表达产物折叠状态接近天然蛋白，不易形成包涵体、溶解度更好，可以更好地保持生物活性。因此，芽孢杆菌在重组蛋白的高效、经济的制备中具有独特的先天优势。目前，芽孢杆菌表达系统已经成功用于酶制剂、多肽类药物、等外源蛋白的规模化制备。
[0004]启动子是基因或操纵子的重要组成部分，是外源基因表达过程中的必需元件。启动子是RNA聚合酶与DNA结合位点，也是起始转录的区域；它的序列通常位于基因编码框的上游。目前，枯草芽孢杆菌启动子主要分为组成型启动子和诱导型启动子两大类。而目前常用芽孢杆菌表达载体表达水平较低，很多芽孢杆菌表达载体表达量不高，表达特异性不强。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种芽孢杆菌表达载体，包括四种芽孢杆菌表达载体，这四种表达载体包含了不同的启动子，均能在芽孢杆菌宿主中表达绿色荧光蛋白和β
‑
半乳糖苷酶基因。
[0006]本专利技术还提供所述芽孢杆菌表达载体的构建方法和应用。
[0007]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种芽孢杆菌表达载体，其包括芽孢杆菌表达载体pTC
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PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2中的任意一种，所述pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
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PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
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PrepUT1T2分别由不同的启动子PlacI
‑
IPTG、Psrf、P43、Prep U及终止子T1T2分别插入pTC、pTN、pBE、pTK载体将序列中构建，所述pTC、pTN、pBE、pTK其碱基序列分别如SEQ ID NO.1
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4所示；所述所述pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
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P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2其碱基序列分别如SEQ ID NO.5
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8所示。所述pTC、pTN、pBE、pTK含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep
‑
ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因Amp
R
和相对应的抗性基因分别为氯霉素抗性基因Cl
R
、新霉素抗性基因Neo
R
、红霉素抗性基因Erm
R
和卡那霉素抗性基因Kana
R
。
[0008]其中pTC、pTN、pBE、pTK四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行穿梭，四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行消除，四种穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中共存，
在先申请的中国专利202111297649.0中有明确记载。
[0009]其中，所述pTC
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PlacI
‑
IPTGT1T2表达载体含有异丙基
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β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷诱导的启动子PlacI
‑
IPTG，能与大肠杆菌的转录阻遏蛋白LacI结合，诱导下游基因的表达，该启动子序列如SEQ ID NO.9所示。
[0010]其中，所述pTN
‑
PsrfT1T2表达载体中的Psrf为时期特异性启动子，在对数生长后期表达酶活性较高，其序列如SEQ ID NO.10所示。
[0011]其中，所述pBE
‑
P43T1T2表达载体中P43为组成型启动子，不需要任何诱导物，可以驱动下游基因持续性表达目的蛋白的启动子，且P43启动子为强组成型启动子，该启动子序列如SEQ ID NO.11所示。
[0012]其中，所述pTK
‑
PrepUT1T2表达载体中PrepU为组成型启动子，不需要任何诱导物，可以驱动下游基因稳定、持表达目的蛋白的启动子，通过构建胞内或分泌表达载体表达目的蛋白，该启动子序列如SEQ ID NO.12所示。
[0013]其中，所述T1T2终止子位于操纵子末端，负责控制转录的终止和目的产物的释放，该终止子序列如SEQ ID NO.13所示。
[0014]本专利技术所述芽孢杆菌表达载体的构建方法，包括以下步骤，从质粒pMUTIN4中获得的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷诱导的启动子PlacI
‑
IPTG，从质粒FZB42中获得的时期特异性启动子Psrf启动子，从质粒FZB42中获得的组成型启动子P43启动子，从质粒GFP中获得的组成型启动子PrepU启动子，从质粒pMUTIN4中获得的终止子T1T2；经过酶切和酶链接将PlacI
‑
IPTG和T1T2插入pTC，将Psrf和T1T2插入pTN，将P43和T1T2插入pBE，将Prep U和T1T2插入pTK分别构建了表达载体pTC
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PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2。
[0015]其中，所述pTC、pTN、pBE、pTK载体的构建为从质粒PUC19中获得大肠杆菌复制起点ori和用于大肠杆菌筛选的氨苄青霉素抗性基因Amp
R
，从质粒pMarA中获得芽孢杆菌热敏复制起点rep
‑
ts、红霉素抗性基因Erm
R
及卡那霉素抗性基因Kana
R
，从质粒载体pBEST502(ECE48)和质粒载体pSG1164(ECE155)中分别获得新霉素抗性基因Neo
R
和氯霉素抗性基因Cl
R
，经过酶切和酶链接构建了系列大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pTC、pBE、pTN和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芽孢杆菌表达载体，其特征在于，包括芽孢杆菌表达载体pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2中的任意一种，所述pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2分别由不同的启动子PlacI
‑
IPTG、Psrf、P43、Prep U及终止子T1T2分别插入pTC、pTN、pBE、pTK载体将序列中构建，所述pTC、pTN、pBE、pTK其碱基序列分别如SEQ ID NO.1
‑
4所示，所述所述pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2、pTN
‑
PsrfT1T2、pBE
‑
P43T1T2和pTK
‑
PrepUT1T2其碱基序列分别如SEQ ID NO.5
‑
8所示。2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述pTC
‑
PlacI
‑
IPTGT1T2表达载体含有异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷诱导的启动子PlacI
‑
IPTG，能与大肠杆菌的转录阻遏蛋白LacI结合，诱导下游基因的表达，该启动子序列如SEQ ID NO.9所示。3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述pTN
‑
PsrfT1T2表达载体中的Psrf为时期特异性启动子，在对数生长后期表达酶活性高，该启动子序列如SEQ ID NO.10所示。4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述pBE
‑
P43T1T2表达载体中P43为组成型启动子，不需要任何诱导物，可以驱动下游基因持续性表达目的蛋白的启动子，且P43启动子为强组成型启动子，该启动子序列如SEQ ID NO.11所示。5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述pTK
...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗楚平，陈悦雯，王小花，张双玉，朱桃，罗科程，田宝霞，张路阳，周孟婷，尹秀莲，张金峰，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：