抗CD19抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗CD19纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1

【技术实现步骤摘要】
抗CD19抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种抗CD19抗体，以及该抗体在制备B细胞恶性肿瘤检测剂和治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]B细胞恶性肿瘤是常见的血液恶性肿瘤，尽管多数患者对目前的一线治疗有反应，但复发率高，预后差，仍然是难治的恶性肿瘤之一。近年，以CD19作为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点受到极大的关注。
[0003]CD19是正常及恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，几乎不在其他细胞表面表达，参与PI3/AKT通路的调节，在B细胞的增殖与分化中起到很至关重要的作用。由于CD19在B淋巴细胞表达的特异性和肿瘤细胞表达的广泛性，且在B细胞恶性转化过程中不丢失，而造血干细胞及pro
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B细胞不表达CD19，治疗停止后，B细胞可以得到有效的补充，因此CD19其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。
[0004]1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
[0005]目前，美国市场已有一些CD19
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CART细胞治疗药物，但是国内目前尚无针对B细胞恶性肿瘤的细胞治疗药物上市，因此迫切需要开发针对CD19的抗体，用于制备B细胞恶性肿瘤等与CD19相关的疾病的治疗药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于B细胞恶性肿瘤治疗。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合CD19的纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1
‑
3，序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。
[0007]在一个具体实施方案中，所述纳米还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3交错排列。例如，可将FR1
‑
4序列设计为如SEQ ID NO:4
‑
7所示(羊驼源)，但本专利技术的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD19的纳米抗体。
[0008]本专利技术还提供了上述纳米抗体在检测细胞表面CD19中的应用。
[0009]本专利技术还提供了上述多肽在制备CD19相关疾病例如B细胞恶性肿瘤的治疗药物中
的应用。
[0010]本专利技术还提供了上述多肽在制备CAT T细胞治疗剂中的应用。
[0011]本专利技术还提供了上述多肽的核酸编码序列及其在制备基因治疗药物中的应用。
[0012]在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
[0013]本专利技术针对B细胞恶性肿瘤进行纳米抗体药物开发，通过制备人CD19蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD19的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的纳米抗体；同时利用流式细胞术鉴定其结合B细胞淋巴瘤细胞的能力。本专利技术为B细胞恶性肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。
附图说明
[0014]图1为CD19第3次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线。
[0015]图2为CD19第4次免疫羊驼一周后的抗血清与表达CD19的Raji细胞上CD19反应的流式效价检测曲线，RPMI8226不表达CD19，为阴性对照细胞。
[0016]图3为CD19
‑
VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图。
[0017]图4为CD19
‑
VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD19蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2
nd
)、第三轮(3
rd
)和第四轮(4
th
)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选40、48、48个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图.
[0018]图5为C19NB283抗体与瞬转表达CD19膜蛋白的293TT细胞的流式结合检测结果。
[0019]图6为C19NB283抗体与Raji细胞的流式结合检测结果。
具体实施方式
[0020]1.免疫原的制备
[0021]我们依据NCBI网站上human CD19的蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对human CD19蛋白的特异性抗体的多肽sCD19，在C端连接His
‑
tag(sCD19
‑
his)或兔Fc(sCD19
‑
rFc)用于后续纯化及检测。
[0022]2.羊驼免疫与抗血清的获得
[0023]用250μg sCD19
‑
rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用sCD19
‑
rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第3次和第4次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血100ml用于噬菌体抗体库的构建。
[0024]抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的sCD19蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti
‑
Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4
‑
6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
[0025]结果如图1及图2所示，图1所示为3免后的抗血清效价为0.36
×
106。图2所示为4免后的血清结合Raji细胞表面CD19的流式效价，为4
×
103。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对Raji细胞表面CD19蛋白的高滴度抗血清。
[0026]3.VHH噬菌体库构建及淘选
[0027]收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CD19纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1
‑
3，序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3按顺序交错排列。3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为羊驼源的VHH或人源化的VHH。4.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴喜林，吴稚伟，王宏伟，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：