本发明专利技术公开了一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞、干细胞制剂及脐带间充质干细胞的制备方法。本申请通过分离脐带组织，将获得的间充质干细胞种子细胞进行细胞因子分泌水平的检测，对符合要求的种子细胞给与添加了炎性因子组合的特定培养基进行传代培养，从而获得免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞。上述制备方法制得的间充质干细胞强化了其免疫调节功能，对免疫调节功能紊乱人群及自身免疫性疾病的治疗更具有针对性。性疾病的治疗更具有针对性。性疾病的治疗更具有针对性。
【技术实现步骤摘要】
免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞、干细胞制剂及脐带间充质干细胞的制备方法
[0001]本专利技术涉及干细胞提取
，具体是一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞、干细胞制剂及脐带间充质干细胞的制备方法。
技术介绍
[0002]人体的免疫系统是保护机体免受病原微生物入侵，维持身体健康的重要防护屏障，当其由于自身原因或外在因素影响造成免疫系统异常时，其正常免疫防御功能发生紊乱，机体对自身抗原发生免疫反应，从而引起各种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症、皮肌炎等。
[0003]自身免疫性疾病发病人群广泛，表现为多组织器官损伤或功能障碍，一般病程较长，常呈现反复发作和慢性迁延的过程，具有较高的致残率和致死率，大多数自身免疫性疾病尚无根治方法。
[0004]近年来，随着研究的深入，间充质干细胞逐渐被广泛应用于再生生物学和实验生物学，并逐渐推广于临床。其多向分化潜能、免疫调节、造血支持以及低免疫原性、无免疫排斥等特点，已在难治性和重症自身免疫性疾病的干预中得到应用，为患者提供了新选择。但是，目前提取到的间充质干细胞免疫调节功能相对较弱，且对自身免疫性疾病的针对性较差，所以，专利技术人认为提供一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞是非常有必要的。
技术实现思路
[0005]本专利技术就是为了解决上述技术问题，所提出了一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞、干细胞制剂及脐带间充质干细胞的制备方法。
[0006]第一方面，本申请提供一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞的制备方法，采用了如下的技术方案。
[0007]一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1.取多根脐带组织，每根脐带组织洗净后均剪成2
‑
3mm3组织块，分别加入原代培养基进行培养，3
‑
4小时后翻面，继续培养7
‑
10天，得到P0代细胞；
[0009]S2.待细胞融合度达到50％
‑
60％，吸弃培养上清并对细胞进行洗涤，然后加入消化液使细胞脱落；
[0010]S3.离心去上清，细胞沉淀用完全培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1：1
‑
1.5的比例接种于完全培养基中，培养3
‑
4天，得到P1代细胞；
[0011]S4.待细胞融合度达到80％以上，分别取培养上清采用酶联免疫吸附法检测PGE2、IDO、TGF
‑
β分泌水平，吸弃培养上清并洗涤细胞，加入消化液使细胞脱落；
[0012]S5.离心弃上清，细胞沉淀用完全培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于完全培养基中，培养3
‑
4天，得到P2代细胞；
[0013]S6.待细胞融合度达到80％以上，根据步骤S4细胞因子分泌水平检测结果，选取细
胞因子分泌水平高的细胞，吸弃培养上清并洗涤细胞，加入消化液使细胞脱落；
[0014]S7.离心去上清，细胞沉淀用定向诱导培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于定向诱导培养基，培养2
‑
4天，得到P3代细胞；
[0015]S8.待细胞融合度达到90％以上，吸弃培养上清并对细胞进行洗涤，然后加入消化液使细胞脱落；
[0016]S9.离心去上清,细胞沉淀用定向诱导培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于定向诱导培养基，培养2
‑
4天，得到P4代细胞；
[0017]S10.按照步骤S8
‑
S9，使细胞继续进行传代培养一次，得到P5代细胞；
[0018]S11.待细胞融合度达到90％以上，吸弃培养上清并洗涤细胞，加入消化液使细胞脱落；
[0019]S12.离心去上清,细胞沉淀用完全培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于完全培养基，继续培养2
‑
4天，即为免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞。
[0020]进一步的，所述完全培养基为含有体积分数为10
‑
15％的胎牛血清的DMEM/F12培养基。
[0021]进一步的，所述定向诱导培养基为含有体积分数为5％
‑
15％的胎牛血清、终浓度为100
‑
500IU/ml的IFN
‑
γ因子、终浓度为100
‑
500IU/ml的TNF
‑
α因子的DMEM/F12培养基。
[0022]第二方面，本申请提供一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞，采用了如下的技术方案。
[0023]一种上述免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞的制备方法制备得到的脐带间充质干细胞。
[0024]第三方面，本申请提供一种干细胞制剂，采用了如下的技术方案。
[0025]一种干细胞制剂，包括上述脐带间充质干细胞。
[0026]本专利技术获得了如下有益效果。
[0027]本申请通过筛选种子细胞、条件诱导培养的方式获得间充质干细胞，其免疫调节相关因子分泌水平显著提高，强化了间充质干细胞调节免疫功能的特性，对自身免疫性疾病的治疗更具有针对性。另外，本申请的制备方法为细胞层面技术，无基因工程改造，操作简便易重复，全程安全可控，细胞制剂使用风险更低。
附图说明
[0028]图1是本专利技术10根脐带细胞因子分泌实验结果图；
[0029]图2是本专利技术两种培养方法获得细胞因子分泌实验结果图；
[0030]图3是本专利技术T细胞集落形成实验结果图。
具体实施方式
[0031]以下参照实施例对本专利技术进行进一步的技术说明。
[0032]一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0033](1)经授权，取检测合格的10(U1
‑
U10)根优质脐带组织，在75％酒精烧杯中浸润10秒取出，氯化钠注射液去血清洗3次后剪成2
‑
3mm3组织块均匀平铺于10个T
‑
75培养瓶底部
(每根脐带组织一瓶)，按照15ml/瓶补加原代培养基后倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3小时后翻面，继续培养。1瓶原代培养基内含胎牛血清112ml、DMEM/F12培养基500ml。
[0034](2)培养10天(P0)，细胞融合度达到50％，移液管吸弃培养上清，氯化钠注射液清洗细胞一次，按照2ml/瓶加入Typle消化液使细胞从培养瓶底部脱落，每瓶中加入20ml生理盐水吹打细胞至完全脱落后，将全部液体转入1个50ml离心管中配平离心。
[0035](3)300g离心8分钟，去上清，细本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.取多根脐带组织，每根脐带组织洗净后均剪成2
‑
3mm3组织块，分别加入原代培养基进行培养，3
‑
4小时后翻面，继续培养7
‑
10天，得到P0代细胞；S2.待细胞融合度达到50％
‑
60％，吸弃培养上清并对细胞进行洗涤，然后加入消化液使细胞脱落；S3.离心去上清，细胞沉淀用完全培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1：1
‑
1.5的比例接种于完全培养基中，培养3
‑
4天，得到P1代细胞；S4.待细胞融合度达到80％以上，分别取培养上清采用酶联免疫吸附法检测PGE2、IDO、TGF
‑
β分泌水平，吸弃培养上清并洗涤细胞，加入消化液使细胞脱落；S5.离心弃上清，细胞沉淀用完全培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于完全培养基中，培养3
‑
4天，得到P2代细胞；S6.待细胞融合度达到80％以上，根据步骤S4细胞因子分泌水平检测结果，选取细胞因子分泌水平高的细胞，吸弃培养上清并洗涤细胞，加入消化液使细胞脱落；S7.离心去上清，细胞沉淀用定向诱导培养基重悬并采用100um滤网过滤，按照1.5
‑
2.5*104/cm2的密度接种于定向诱导培养基，培养2
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4天，得到P3代细胞；S8.待细胞融合度达到90％以上，吸弃培养上清并对细胞进行洗涤，然后加入消...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓波，韩颢，韩洪起，冯春玲，吴学涛，
申请(专利权)人：优赛医疗科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：
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