【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测序反应的聚合酶
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.S.
§
119(e)主张2019年6月28日申请的美国临时专利申请第62/868,806号及2020年3月23日申请的美国临时专利申请第62/993,597号的优先权,其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
[0003]DNA聚合酶是所有活生物体的基因组复制所必需的核苷酸聚合酶。除其在复制及修复期间保持基因组完整性方面的作用之外,DNA聚合酶也广泛用于体外DNA操控,包括DNA克隆、诱变及测序。DNA聚合酶根据模板DNA合成互补链的基本能力是保守的,尽管特定特性,包括持续效力、保真性及底物核苷酸选择性在不同酶中有所不同。
技术实现思路
[0004]本文中所公开的技术的方面是关于可用于进行体外聚合反应的经修饰的聚合酶(polymerizing enzymes)(例如聚合酶(polymerases))。在一些方面中,本文中所描述的聚合酶适合用于测序反应(例如核酸测序)。在一些方面中,本专利技术提供具有一或多个修饰的重组聚合酶。在一些实施方案中,本专利技术的重组聚合酶包含氨基酸突变或域取代中的至少一个。
[0005]在一些方面中,本专利技术提供具有基于天然存在聚合酶(例如选自表1)且包括一或多个氨基酸突变和/或区段取代的氨基酸序列的经修饰的聚合酶(例如核酸聚合酶(nucleic acid polymerizing enzyme/nucleic acid polymerase))。在一些实施方案中,经修 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经修饰的重组酶,其包含第一区段及第二区段,其中:所述第一区段包含对应于第一参考区段的氨基酸序列,所述第一参考区段含有SEQ ID NO:2的氨基酸197至271,其中所述第一区段的氨基酸序列与所述第一参考区段的氨基酸序列至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致,且其中所述第一区段具有高于所述第一参考区段的等电点;及所述第二区段包含对应于第二参考区段的氨基酸序列,所述第二参考区段含有SEQ ID NO:2的氨基酸443至528,其中所述第二区段的氨基酸序列与所述第二参考区段的氨基酸序列至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致,且其中所述第二区段具有高于所述第二参考区段的等电点。2.一种经修饰的重组酶,其包含第一区段,所述第一区段包含对应于参考区段的氨基酸序列,所述参考区段含有SEQ ID NO:2的氨基酸1至196,其中所述第一区段的氨基酸序列与所述参考区段的氨基酸序列至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致;且其中所述第一区段具有高于所述参考区段的等电点。3.一种经修饰的重组酶,其包含第一区段及第二区段,其中:所述第一区段包含对应于第一参考区段的氨基酸序列,所述第一参考区段含有SEQ ID NO:2的氨基酸1至271,其中所述第一区段的氨基酸序列与所述第一参考区段的氨基酸序列至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致,且其中所述第一区段具有高于所述第一参考区段的等电点;及所述第二区段包含对应于第二参考区段的氨基酸序列,所述第二参考区段含有SEQ ID NO:2的氨基酸443至528,其中所述第二区段的氨基酸序列与所述第二参考区段的氨基酸序列至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致,且其中所述第二区段具有高于所述第二参考区段的等电点。4.如权利要求1至3中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的K4、T13、S22、V25、C26、D27、N33、I34、F36、S42、D54、N59、E60、E65、E85、M95、N106、T110、T114、K119、Q122、Y133、P136、E139、E142、N145、P147、I148、E152、I153、P160、D167、D171、N175、F188、D189、Q206、T211、S216、R217、D232、A236、V247、I253、V261、L264、S267、V443、L445、A446、S447、V449、T450、W452、G453、Y455、F465、N467、T479、E482、A484、E485、A486、L490、D492、S493、K495、K500、S503、Q506、Q513、E519、D521、E523及V526。5.如权利要求4的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:K4R、T13N、S22A、V25L、C26W、D27E、N33T、I34V、F36V、S42T、D54Y、N59D、E60L、E60V、E65S、E85P、M95T、M95K、N106G、T110I、T114S、K119Q、Q122V、Y133L、P136T、E139K、E139Q、E139R、E139H、E142K、E142Q、E142R、E142H、N145K、N145H、N145R、P147Q、P147T、I148K、I148H、I148R、E152D、I153V、P160A、D167P、D167K、D167H、D167R、D171K、D171H、D171R、N175T、N175Y、F188C、D189K、D189H、D189R、Q206R、Q206K、Q206H、T211A、S216G、S216R、R217G、D232K、A236G、V247D、I253H、I253A、V261A、V261I、V261L、L264H、L264A、L264M、S267A、V443T、L445M、A446G、S447V、V449I、T450A、W452Y、G453A、Y455W、F465Y、N467R、N467K、N467H、N467S、N467T、T479V、E482K、E482H、E482R、A484E、E485D、A486E、L490M、D492H、D492K、D492R、D492A、H492S、S493P、K495R、K500E、S503A、S503T、Q506K、Q513D、D521K、
D521R、D521H、E523R、E523V、E523Y、E523F、E523H、E523W及V526L。6.如权利要求3或4的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:E139、E142、N145、I148、D167、D171、D189、N467、E482、D492、K495、D521及E523。7.如权利要求6的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:E139K、E139Q、E139R、E139H、E142K、E142H、E142R、E142Q、N145K、N145H、N145R、I148K、I148H、I148R、D167P、D167K、D167H、D167R、D171K、D171H、D171R、D189K、D189H、D189R、N467R、N467K、N467H、N467S、N467T、E482K、E482H、E482R、D492H、D492K、D492R、K495R、D521K、D521H、D521R、E523K、E523Y、E523H、E523R、E523F及E523W。8.如权利要求1至7中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的P273、P275、R308、V315、Q317、S319、L320、I322、Q323、D337、E338、D341、T345、F352、F353、T364、D374、I384、E385、N388、E391、A396、N397、G400、D414、D425、R429、E436、L437、D533、R534、E537、G547、E545、L555、P556、R558、T559、V564、T568、M569及T571。9.如权利要求8的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:P273S、P273R、P275S、E283K、V315L、S319R、R308G、G308R、Q317R、S319R、L320M、L320T、I322K、Q323G、Q323V、Q323R、D337G、E338K、D341T、T345I、F352I、F353C、T364I、D374G、D374Q、D374H、I384T、I384F、I384S、E385Y、E385K、E385R、E385N、E385Q、E385L、E385A、N388T、E391Y、E391W、E391F、E391H、E391M、E391K、E391R、A396Q、N397L、G400L、D414V、D425N、R429G、E436R、E436G、L437Y、L437E、D533A、D533Q、D533T、D533R、D533S、R534K、E537K、E537H、E537R、E545K、E545H、E545R、G547S、L555K、L555R、P556A、R558H、T559V、V564L、T568D、T568S、M569K、M569T、M569V及T571S。10.如权利要求8的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:D374G、D374Q、D374H、E385Y、E385K、E385R、E385N、E385Q、E385L、E385A、E391Y、E391W、E391K、E391F、D533A、D533Q、D533T、D533R、D533S、E537K、E537H、E537R、E545K、E545H及E545R。11.如权利要求8至10中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含表7中所列的修饰的组合。12.如权利要求1至11中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的E142、I148、D189、V261、L264、R308、E391、E482、D492、K500、D521、E523及E537。13.如权利要求12的经修饰的重组酶,其中:位置E142处的修饰为E142K;位置I148处的修饰为I148K;位置D189处的修饰为D189K;位置V261处的修饰为V261A;位置L264处的修饰为L264H;位置R308处的修饰为R308G;位置E391处的修饰为E391Y;
位置E482处的修饰为E482K;位置D492处的修饰为D492H;位置K500处的修饰为K500E;位置D521处的修饰为D521K;位置E523处的修饰为E523K;及位置E537处的修饰为E537K。14.如权利要求13的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。15.如权利要求13的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含位置E60处的修饰。16.如权利要求15的经修饰的重组酶,其中E60处的修饰为E60L。17.如权利要求16的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。18.如权利要求17的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶进一步包含双生物素标签。19.如权利要求18的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。20.一种经修饰的重组酶,其包含一或多个选自以下的区段:具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至196至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列的第一区段,其中所述第一区段的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的K4、T13、S22、V25、C26、D27、N33、I34、F36、S42、D54、N59、E60、E65、E85、M95、N106、T110、T114、K119、Q122、Y133、P136、E139、E142、N145、P147、I148、E152、I153、P160、D167、D171、N175、F188及D189;具有与SEQ ID NO:2的氨基酸197至271至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列的第二区段,其中所述第二区段的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的Q206、T211、S216、R217、D232、A236、V247、I253、V261、L264及S267;和/或具有与SEQ ID NO:2的氨基酸443至528至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列的第三区段,其中所述第三区段的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的V443、L445、A446、S447、V449、T450、W452、G453、Y455、F465、N467、T479、E482、A484、E485、A486、L490、D492、S493、K495、K500、S503、Q506、Q513、E519、D521、E523及V526。21.如权利要求20的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含所述第一区段及所述第二区段。22.如权利要求20的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含所述第二区段及所述第三区段。23.如权利要求20的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含所述第一区段及所述第三区段。24.如权利要求20的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含所述第一区段、所
述第二区段及所述第三区段。25.如权利要求20至24中任一项的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:K4R、T13N、S22A、V25L、C26W、D27E、N33T、I34V、F36V、S42T、D54Y、N59D、E60L、E60V、E65S、E85P、M95T、M95K、N106G、T110I、T114S、K119Q、Q122V、Y133L、P136T、E139K、E139Q、E139R、E139H、E142K、E142Q、E142R、E142H、N145K、N145H、N145R、P147Q、P147T、I148K、I148H、I148R、E152D、I153V、P160A、D167P、D167K、D167H、D167R、D171K、D171H、D171R、N175T、N175Y、F188C、D189K、D189H、D189R、Q206R、Q206K、Q206H、T211A、S216G、S216R、R217G、D232K、A236G、V247D、I253H、I253A、V261A、V261I、V261L、L264H、L264A、L264M、S267A、V443T、L445M、A446G、S447V、V449I、T450A、W452Y、G453A、Y455W、F465Y、N467R、N467K、N467H、N467S、N467T、T479V、E482K、E482H、E482R、A484E、E485D、A486E、L490M、D492H、D492K、D492R、D492A、H492S、S493P、K495R、K500E、S503A、S503T、Q506K、Q513D、D521K、D521R、D521H、E523R、E523V、E523Y、E523F、E523H、E523W及V526L。26.如权利要求20至25中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:E139、E142、N145、I148、D167、D171、D189、N467、E482、D492、K495、D521及E523。27.如权利要求26的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:E139K、E139Q、E139R、E139H、E142K、E142H、E142R、E142Q、N145K、N145H、N145R、I148K、I148H、I148R、D167P、D167K、D167H、D167R、D171K、D171H、D171R、D189K、D189H、D189R、N467R、N467K、N467H、N467S、N467T、E482K、E482H、E482R、D492H、D492K、D492R、K495R、D521K、D521H、D521R、E523K、E523Y、E523H、E523R、E523F及E523W。28.如权利要求20至27中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的P273、P275、R308、V315、Q317、S319、L320、I322、Q323、D337、E338、D341、T345、F352、F353、T364、D374、I384、E385、N388、E391、A396、N397、G400、D414、D425、R429、E436、L437、D533、R534、E537、G547、E545、L555、P556、R558、T559、V564、T568、M569及T571。29.如权利要求28的方法,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:P273S、P273R、P275S、E283K、V315L、S319R、R308G、G308R、Q317R、S319R、L320M、L320T、I322K、Q323G、Q323V、Q323R、D337G、E338K、D341T、T345I、F352I、F353C、T364I、D374G、D374Q、D374H、I384T、I384F、I384S、E385Y、E385K、E385R、E385N、E385Q、E385L、E385A、N388T、E391Y、E391W、E391F、E391H、E391M、E391K、E391R、A396Q、N397L、G400L、D414V、D425N、R429G、E436R、E436G、L437Y、L437E、D533A、D533Q、D533T、D533R、D533S、R534K、E537K、E537H、E537R、E545K、E545H、E545R、G547S、L555K、L555R、P556A、R558H、T559V、V564L、T568D、T568S、M569K、M569T、M569V及T571S。30.如权利要求28的方法,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:D374G、D374Q、D374H、E385Y、E385K、E385R、E385N、E385Q、E385L、E385A、E391Y、E391W、E391K、E391F、D533A、D533Q、D533T、D533R、D533S、E537K、E537H、E537R、E545K、E545H、E545R。31.如权利要求28至30中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含表7中所列的修饰的组合。32.如权利要求20至31中任一项的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基
酸序列包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的E142、I148、D189、V261、L264、R308、E391、E482、D492、K500、D521、E523及E537。33.如权利要求32的经修饰的重组酶,其中:位置E142处的修饰为E142K;位置I148处的修饰为I148K;位置D189处的修饰为D189K;位置V261处的修饰为V261A;位置L264处的修饰为L264H;位置R308处的修饰为R308G;位置E391处的修饰为E391Y;位置E482处的修饰为E482K;位置D492处的修饰为D492H;位置K500处的修饰为K500E;位置D521处的修饰为D521K;位置E523处的修饰为E523K;及位置E537处的修饰为E537K。34.如权利要求33的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。35.如权利要求33的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶的氨基酸序列包含位置E60处的修饰。36.如权利要求35的经修饰的重组酶,其中E60处的修饰为E60L。37.如权利要求36的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。38.如权利要求36的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶进一步包含双生物素标签。39.如权利要求38的经修饰的重组酶,其中所述经修饰的重组酶包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。40.一种经修饰的重组酶,其包含含有以下的氨基酸序列:(i)第一区段、第二区段、第三区段、第四区段、第五区段、第六区段及第七区段;及(ii)在对应于SEQ ID NO:2的E139、E142、N145、I148、D167、D171、D189、D374、E385、E391、N467、E482、D492、K495、D521、E523、D533、E537及E545的一或多个位置处的修饰;其中所述第一区段包含与表1、表2或表3的聚合酶的外切核酸酶区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列;所述第二区段及所述第六区段共同包含与表1、表2或表3的聚合酶的掌型区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列;所述第三区段包含与表1、表2或表3的聚合酶的TPR1区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列;所述第四区段包含与表1、表2或表3的聚合酶的手指型区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列;
所述第五区段包含与表1、表2或表3的聚合酶的TPR2区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列;及所述第七区段包含与表1、表2或表3的聚合酶的拇指型区域至少80%、80至90%、90至95%或至少95%一致的氨基酸序列。41.如权利要求40的经修饰的重组酶,其中修饰为选自由以下组成的组的氨基酸取代:E139K、E139Q、E139R、E139H、E142K、E142H、E142R、E142Q、N145K、N145H、N145R、I148K、I148H、I148R、D167P、D167K、D167H、D167R、D171K、D171H、D171R、D189K、D189H、D189R、D374G、D374Q、D374H、E385Y、E385K、E385R、E385N、E385Q、E385L、E385A、E391Y、E391W、E391K、E391F、N467R、N467K、N467H、N467S、N467T、E482K、E482H、E482R、D492H、D492K、D492R、K495R、D521K、D521H、D521R、E523K、E523Y、E523H、E523R、E523F、E523W、D533A、D533Q、D533T、D533R、D533S、E537K、E537H、E537R、E545K、E545H、E545R。42.如权利要求40或41的经修饰的重组酶,其进一步包含对应于以下的一或多个位置处的修饰:SEQ ID NO:2的K4、T13、S22、V25、C26、D27、N33、I34、F36、S42、D54、N59、E60、E65、E85、M95、N106、T110、T114、K119、Q122、Y133、P136、P147、E152、I153、P160、N175、F188、Q206、T211、S216、R217、D232、A236、V247、I253、V261、L264、S267、P273、P275、R308、V315、Q317、S319、L320、I322、Q323、D337、E338、D341、T345、F352、F353、T364、I384、N388、A396、N397、G400、D...
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