引物和使用了该引物的双链DNA的制造装置以及双链DNA的制造方法制造方法及图纸

本发明专利技术为一种引物，该引物用于核酸的扩增，具有下述式(1)所示的结构。(这里，B表示碱基，R1表示分解性保护基，R2表示氢或羟基。＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。)。本发明专利技术还为一种双链DNA的制造装置，具备：具有式(1)所示的结构的正向引物和反向引物；PCR装置，以模板DNA为模板进行多个循环的PCR，生成3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引物和使用了该引物的双链DNA的制造装置以及双链DNA的制造方法


[0001]本专利技术涉及一种引物和使用了该引物的双链DNA的制造装置以及双链DNA的制造方法。

技术介绍

[0002]在分子生物学等领域，为了进行基因重组或转化等，使用将目标DNA整合到宿主中而得的载体。通常，在目标DNA的量少的情况下，通过聚合酶链反应(PCR)扩增后使用。在PCR中，使用包含目标DNA序列的模板DNA，使用与其互补性地结合的引物反复进行多个循环的热变性和退火，从而扩增模板DNA。
[0003]通过PCR扩增的模板DNA的扩增产物直接是平滑末端，为了使其与质粒DNA等宿主DNA结合(连接)而需要进行处理。通常，作为这样的处理，使用切割特定序列的限制酶，但在该方法中由于可结合的DNA依赖于限制酶的切割位点的序列，因此存在缺乏通用性的问题。
[0004]作为不使用限制酶的方法，有以下的技术：以扩增产物的3
’
末端和5
’
末端作为粘附末端(也称为粘合末端、突出末端等)，在宿主侧也同样地形成粘附末端，连接两者以构建载体。例如，近年来，已知有Gibson装配(Gibson assembly)法、In－Fusion法、SLiCE法等。在这些方法中，均在双链DNA片段末端具有15bp左右的相同序列，利用核酸外切酶活性消化双链中的一侧的链使产生粘附末端，之后进行连接。此外，在Gibson装配法中，在体外使用Taq DNA连接酶进行连接，而在In－Fusion法中利用大肠杆菌内的修复系统进行连接。<br/>[0005]在这些方法中，由于使用作为酶的核酸外切酶，所以除了花费成本以外，有时还因反应条件等导致位点特异性变差，难以形成定量的粘附末端，所以存在连接反应的效率低的问题。因此，寻求不使用酶的无缝克隆法。
[0006]因此，开发了利用化学方法调制具有粘附末端的DNA的方法，作为用于此方法的PCR用引物，已知有专利文献1中记载的引物。该文献的引物中相当于非互补性DNA部分的核苷酸序列中的3
’
末端的碱基用保护基修饰。该保护基具有使利用DNA聚合酶进行的DNA复制停止进行的功能，通过光照射处理或碱处理等可从被修饰碱基脱离。另外，在该文献中，使用用于向生物体分子内引入保护基(取代基)的取代基引入剂，将碱基保护基引入到引物的碱基中。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1：国际公开第2009/113709号(权利要求1、权利要求2等)。

技术实现思路

[0010]专利技术要解决的技术问题
[0011]在专利文献1中，虽然是在保护基部分终止进行DNA复制，但在碱基部分由于保护基而阻碍聚合酶活性，因此终止效率低，其结果，有时会完全延伸。另外，例如在DNA中碱基
有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶这4种，但在专利文献1中，为了向碱基中引入保护基，需要通过与碱基种类相应的方法引入保护基，在引物的制造上费事且花费成本。
[0012]本专利技术的目的在于提供一种终止效率高、并且可廉价地制造的引物。另外，本专利技术的另一目的还在于：提供一种使用这样的引物的具有粘附末端的双链DNA的制造装置和双链DNA的制造方法。
[0013]解决技术问题的方法
[0014]为了解决上述问题，本专利技术人反复进行了深入研究。其结果，开发了一种在核苷的糖部分引入了分解性保护基的引物。而且，还发现了：通过分解其保护基，可制作具有粘附末端的双链DNA，完成了本专利技术。
[0015]即，本专利技术为一种引物，其特征在于：其是用于核酸的扩增的引物，具有下述式(1)所示的结构。
[0016][0017](这里，B表示碱基，R1表示分解性保护基，R2表示氢或羟基。＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。)
[0018]这种情况下，优选上述R1为下述式(2A)所示的光分解性保护基。
[0019][0020](这里，A1表示碳原子数为1～3的亚烷基，可具有碳原子数为1～20的支链。＊是指与磷酸的氧(O)的键。)
[0021]而且，这种情况下，优选上述R1为下述式(4A)所示的光分解性保护基。
[0022][0023](这里，R3表示碳原子数为1～20的烷基。)
[0024]在上述情况下，更优选上述R3为叔丁基或金刚烷基。特别是R3为叔丁基适合。
[0025]而且，优选上述R1为下述式(3A)所示的2－硝基苄基。
[0026][0027]或者，优选上述R1为下述式(2B)所示的还原剂分解性保护基。
[0028][0029](这里，A2表示碳原子数为1～3的亚烷基，可具有碳原子数为1～20的支链。＊是指与磷酸的氧(O)的键。)
[0030]这种情况下，优选上述R1为下述式(3B)所示的4－硝基苄基。
[0031][0032]优选在序列中有2个以上的上述式(1)所示的结构连续。
[0033]另外，本专利技术为一种双链DNA的制造装置，其是用于使用上述任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA制造装置，其特征在于，具备：正向引物，与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补，并且具有上述式(1)所示的结构；反向引物，与上述模板DNA的有义链的一部分序列互补，并且具有上述式(1)所示的结构；扩增设备，以上述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成上述正向引物延伸的正向侧延伸链和上述反向引物延伸的反向侧延伸链，将上述正向侧延伸链和上述反向侧延伸链退火以生成3
’
末端凹陷的双链DNA；以及脱保护设备，将上述R1脱保护。
[0034]而且，本专利技术还为一种双链DNA的制造方法，其是用于使用上述任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA制造方法，其特征在于，具有以下工序：准备工序，准备正向引物和反向引物，该正向引物与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补、且具有上述式(1)所示的结构，该反向引物与上述模板DNA的有义链的一部分序列互补、且具有上述式(1)所示的结构；扩增工序，以上述模板DNA为模板进行多个循环的聚合酶链反应(PCR)，生成上述正向引物延伸的正向侧延伸链和上述反向引物延伸的反向侧延伸链，将上述正向侧延伸链和上述反向侧延伸链退火，生成3
’
末端凹陷的双链DNA；以及脱保护工序，将上述R1脱保护。
[0035]这种情况下，上述R1为上述式(2A)所示的光分解性保护基，脱保护工序优选通过光照射将上述R1脱保护。
[0036]或者，上述R1为上述式(2B)所示的还原剂分解性保护基，脱保护工序优选利用还原剂将上述R1脱保护。
[0037]另外，上述引物优选在序列中有2个以上的上述式(1)所示的结构连续。
[0038]专利技术效果
[0039]根据本专利技术，可提供一种脱保护效率高、并且可廉价地制造的引物。另外，根据本专利技术，还可提供一种使用这样的引物的具有粘附末端的双链DNA的制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种引物，其特征在于：其是用于核酸的扩增的引物，具有下述式(1)所示的结构，这里，B表示碱基，R1表示分解性保护基，R2表示氢或羟基，＊是指与相邻的核苷酸的糖的键。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(2A)所示的光分解性保护基，这里，A1表示碳原子数为1～3的亚烷基，可具有碳原子数为1～20的支链，＊是指与磷酸的氧(O)的键。3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(4A)所示的光分解性保护基，这里，R3表示碳原子数为1～20的烷基。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于：所述R3为叔丁基或金刚烷基。5.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(3A)所示的2－硝基苄基，6.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(2B)所示的还原剂分解性保护基，这里，A2表示碳原子数为1～3的亚烷基，可具有碳原子数为1～20的支链，＊是指与磷酸的氧(O)的键。7.根据权利要求6所述的引物，其特征在于：所述R1为下述式(3B)所示的4－硝基苄基，
8.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：在序列中有2个以上的所述式(1)所示的结构连续。9.一种双链DNA的制造装置，其是用于使用权利要求1～8中任一项所述的引物制造具有粘附末端的双链DNA的双链DNA制造装置，其特征在于，具备：正向引物，与作为模板的模板DNA的反义链的一部分序列互补，并且具有所述式(1)所示的结构；反向引物，与所述模板DNA的有义链的一部分序列互补，并且具有所述式(1)所示的结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿部洋，阿部奈保子，中本航介，村濑裕贵，木村康明，
申请(专利权)人：国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：