禽肠样体制造技术

提供了用作禽肠的模型的衍生自禽肠组织的体外三维细胞构建体，其包含组织成肠绒毛和隐窝的禽细胞。适当地，构建体包含模拟鸡肠道的顶端表面的外表面。还提供了制造细胞构建体的方法和构建体作为体外肠模型系统以检查试剂的用途，所述试剂包括但不限于微生物、疫苗、药物、饲料添加剂、毒素、益生元(pre

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】禽肠样体
专利

[0001]本专利技术涉及三维(3D)肠样体培养物，其可以例如用于多细胞生物学机制的研究。特别地，本专利技术涉及模拟禽体内肠的肠样体培养物。还提供了肠样体培养物研究例如细胞生物学、宿主
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病原体相互作用、食品科学和药物的用途。
[0002]背景
[0003]哺乳动物三维(3D)类器官反映了体内组织的组织，是调查肠细胞生物学和宿主
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病原体相互作用的有力工具。已经在各种哺乳动物物种中发展了从哺乳动物成体干细胞中不断扩增生长的自我组织肠类器官或肠样体的专业知识。通过分离肠隐窝或单个多能成体干细胞，将它们嵌入凝胶支架(通常是称为基质胶(Matrigel)的Engelbreth
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Holm
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Swarm肿瘤提取物)并添加外部确定的生长因子；表皮生长因子(EGF)、R
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spondin和头蛋白，可以生成哺乳动物3D肠样体，该3D肠样体有有组织的隐窝和绒毛结构域、高度极化的上皮、功能性腔室并含有所有正常比例的分化细胞类型。隐窝进入内层是所有绒毛谱系的成熟上皮细胞的中央腔室，该成熟上皮细胞顶端刷状缘结构域面向腔室内。相反，基底外侧表面与细胞外基质(ECM)支架接触。
[0004]鼠培养系统已用于其他哺乳动物，但需要额外的生态位因子(niche factor)来概括干细胞自我更新和分化层次，该生态位因子包括Wnt3a、烟酰胺、分子抑制剂间变性淋巴瘤激酶(TGF
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β抑制剂)和p38丝裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂。
[0005]Co等人(Cell Reports(2019)26,2509
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2520)提供了具有基底细胞表面的人和鼠肠样体，当在补充有ECM蛋白的凝胶支架中生长时，该基底细胞表面朝外，但当细胞构建体随后从支持凝胶支架中回收、转移并在悬浮液中培养时，顶端表面朝外展示证明了这些肠样体逆转了它们的极性。细胞外基质蛋白已被识别为这种上皮极性变化的关键调节因子之一。漂浮的鼠类隐窝迅速解离成杂乱无章的细胞团块，这可能是由于整联蛋白信号传导通过基底膜附着丢失导致。细胞构建体的解离限制了这些构建体作为模型系统的功用。
[0006]Powell等人(Biology Open(2017)6 698
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705)讨论了来自各种大型农场和小型伴侣动物的肠类器官的繁殖。虽然这在所提供的肠样体中列出了鸡肠样体，但很明显，使用本文教导的基质胶和标准生长因子Wnt3a、R
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spondin
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3和头蛋白(WRN)的哺乳动物方法的用途导致提供球状体而不是肠样体。Pierzchalska等人(Methods in Molecular Biology(2019)1576:135
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144)表明，在发育的最后三天从胚胎鸡胎中分离的肠上皮可用于建立肠类器官的3D培养物。然而，在本文讨论的方法中，当上皮组织的碎片嵌入细胞培养插入物的基质胶基质中时，观察到被上皮细胞覆盖的空球状体的形成。这种方法不会或很少形成类似于哺乳动物肠样体的隐窝绒毛结构，而是形成球状体而不是肠样体。
[0007]类器官很容易缩小单细胞培养和体内研究之间的差距，其由与组织和起源物种互补的上皮组成，适用于与细胞系相同的分析技术，并且可以进行基因操作。肠哺乳动物类器官的3D几何形状和内腔的实际限制是它们无法轻松接近顶端上皮。为确保与感染的自然部位相互作用，测试的病原体或任何其他试剂必须是；显微注射到肠样体腔室中，在传代过程中添加到解离的细胞中或必须开发2D肠样体模型。
[0008]尽管哺乳动物肠样体成功生长，禽肠样体的生产迄今为止产生的结果有限。使用对其他物种成功的微环境的方法导致薄壁结构没有明确的隐窝和绒毛样结构域，并且这些结构与在体内肠中发现的分化细胞的形态或阵列不同。
[0009]专利技术概述
[0010]为了解决对具有与原始体内肠相等架构和多谱系分化的禽物种体外微型肠道模型的需求，专利技术人调查了替代的禽干细胞分离程序，特别是上皮干细胞分离程序，例如来自肠壁、绒毛和/或隐窝组织。因为迄今为止，其他物种成功的微环境在生产禽肠样体的结果有限，已经调查了进一步的替代类肠体培养技术。
[0011]类器官这个术语可以被认为是包罗万象的术语，它可以代表仅上皮系统和上皮加上非上皮组分(间充质/基质、免疫细胞、神经元等)。类器官可以衍生自不同的来源(即任何原代组织或多能干细胞)。类器官是衍生自原代组织的3维结构，并在人工生态位中生长。它们是“类似于器官”的结构，并满足以下标准：(1)含有建立或保留被建模器官身份的细胞的3D结构，(2)存在多种细胞类型，像在器官本身中。(3)根据与器官本身相同的内在组织原则进行自我组织。从可诱导的多能干细胞发育而来的培养物通常被称为可诱导肠类器官。
[0012]从分离的原代胃肠组织或干细胞发育而来的原代培养物形成3维结构，模仿绒毛和隐窝结构域，这与体内肠的构架相当，被称为肠样体或肠类器官。相比之下，球状体通常被认为是从分离的肠组织或干细胞发育而来的原代培养物，其缺乏模拟绒毛和隐窝结构域的3维结构，因此无法与体内肠的架构进行比较。
[0013]Pierzchalska等人尽管使用了类器官这个术语来讨论本文的悬滴培养物，但他们也将这些培养物称为球状体或上皮球，正如他们承认这些培养物不含有器官本身中的多种细胞类型，即杯状、潘氏、肠内分泌细胞。
[0014]试图在以前成功用于其他物种的微环境中使鸡肠样体生长，产生对禽有限的结果，揭示了没有明确的隐窝和绒毛样结构域的薄壁结构。使用常规技术，接种在基质胶中的禽肠18胚胎日(ED)绒毛迅速形成球状结构，在培养7天后其大小增加；然而，该架构仍然是基本的，没有明确定义的隐窝
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绒毛发育。这些球状体和原代鸡肠单层与在体内肠中发现的分化细胞的形态或阵列不同。
[0015]专利技术人已经确定了用于提供由多种分化的肠上皮细胞类型组成的多叶的3D禽肠样体的方法。适当地，它们包含上皮和间充质谱系。肠样体可被认为类似于器官，因为它们具有3D结构，其中含有来提供被建模的器官的身份的细胞，它们具有如器官本身中一样的多种细胞类型并根据器官的组织原则进行自我组织。通过省略基质胶而仅将鸡绒毛/隐窝单独在培养基中漂浮，肠样体形态显著改善，向专利技术人表明基质的组分负责抑制肠样体出芽。特别是，与以前的方法相反，在以前的方法中肠样体逆转其极性以变成顶端向外，本方法不需要在基质胶中预先培养，随后恢复和重新悬浮。适当地，在本方法中，肠样体在悬浮液的顶端表面向外生长。肠样体包含绒毛
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隐窝结构，其可以在体内维持禽肠上皮内层展示出的细胞多样性、极性和屏障功能。特别地，专利技术人已经确定了使用肠上皮干细胞从分离的禽组织中提供肠样体的方法。适当地，肠上皮干细胞可以从绒毛和/或隐窝组织中分离。适当地，肠上皮干细胞可以从含有干细胞的肠碎片中分离。适当地，干细胞可以从胚胎肠上皮组织中分离。适当地，干细胞可以从胚胎本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用作禽肠的模型的衍生自禽肠组织的体外三维细胞构建体，其包含组织成肠绒毛和隐窝的禽细胞。2.权利要求1的体外细胞构建体，其中所述构建体包含模拟鸡肠的顶端表面的表面。3.权利要求1或2中任一项的体外细胞，其中所述构建体包含模拟鸡肠的顶端表面的外表面。4.前述权利要求中任一项的体外细胞构建体，其中所述细胞构建体是肠样体。5.权利要求1至4中任一项的体外细胞构建体，其包含(a)核心(b)包含顶端上皮细胞表面的外部。6.培养包含组织成肠绒毛和隐窝的禽细胞的体外三维细胞构建体的方法，所述方法包括以下步骤a)提供来自禽的肠组织的分离细胞至培养基，以提供具有接种细胞的培养基，b)扩增漂浮在所述培养基中的所述接种细胞以形成至少一个肠样体。7.权利要求6的方法，其中所述方法不需要提供细胞外基质。8.权利要求6或7中任一项的方法，其中所述分离细胞是从禽肠绒毛或肠隐窝中分离的。9.权利要求6至8中任一项的方法，其中通过在培养基中漂浮来接种所述分离细胞，任选地其中所述培养基是由DMEM/F12和B27补充物组成的基础培养基。10.针对活性筛选试剂的方法，所述方法包括以下步骤a.提供至少一种权利要求1至5中任一项的细胞构建体，b.在体外将所述试剂与所述细胞构建体接触，c.确定所述试剂对所述细胞构建体的细胞的活性或作用。11.用于权利要求6至10中任一项的方法的装置，其中所述装置包含：a.微流体装置，其包含腔室和与所述腔室流体连通的至少第一通道，b.权利要求1至5中任一项的细胞构建体，任选地c.所述腔室中的生长培养基。12.培养权利要求1至5中任一项的细胞构建体的方法，所述方法包括：a.提供权利要求11的装置，b.在第一时间点在所述腔室中提供生长培养基以促进所述细胞的生长。13.权利要求1至5中任一项的包含组织成肠绒毛和隐窝的禽细胞的体外三维细胞构建体在至少一个选自由以下项组成的组中的用途：检查微生物相互...

【专利技术属性】
技术研发人员：A弗韦尔德，EJ纳什，
申请(专利权)人：爱丁堡大学理事会，
类型：发明
国别省市：