单细胞胞内捕获的方法及其应用技术

本公开提供了用于在细胞内高通量条码化核酸和/或蛋白质的方法。细胞内单细胞捕获方法使用个体细胞本身作为隔室，并将多种独特标识符(如条形码)递送到细胞内，直接捕获细胞内的核酸和/或蛋白质靶标。它显著简化了单细胞分析实验设置，并消除了对外部隔室生成的需要。它提供了高通量的单细胞表达谱分析和细胞蛋白定量的方法。带有细胞内捕获的靶向测序能够显著增强对于低频率突变(例如在癌症很早期的体细胞突变)检测的灵敏度和特异性，真正实现早期癌症检测。现早期癌症检测。现早期癌症检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞胞内捕获的方法及其应用
[0001]本专利申请要求2019年3月12日提交的临时文件US62817106和2019年6月6日提交的临时文件US62858270的优先权。其整体引入本文。本文中述及的所有出版物、专利和其他文件都通过引用全文纳入本文。


[0002]本专利技术涉及单细胞检测和测序的一般方法。特别地，本文提供的方法涉及在大规模并行规模中制备从个体细胞中捕获核酸和/或蛋白质，以及其在细胞鉴定、基因表达谱分析、基因分型、肿瘤细胞检测和蛋白质定量方面的应用。

技术介绍

[0003]在过去十年间，已经测序了来自各种不同物种的大量基因组。还有更多的组织和细胞样品已经针对其基因组特征和转录组概况被测序。同一组织中的细胞通常被认为是具有相同状态的功能单元。在大多数情况下，测序的核酸样本是从数百至数百万个混合在一起的细胞中提取的。这种对数千个细胞的批量测序分析了细胞群体的总体反应和稳定状态，它平均了个体细胞的差异，可能无法精确解释生物体的生长和发育机制。最近研究个体细胞的能力为了解细胞间的个体差异打开了新的窗口(Janiszewska等，2015)。细胞在增殖、分化和代谢过程中与内部和外部因素的相互作用造成了细胞间的许多差异。即使是同源细胞，胞内物质的组成和含量也有很大的不同。最近关于高效和准确捕获单细胞的技术的进展使得研究人员能够检测个体细胞之间的细微变化(Spitzer和Nolan，2016和Zeisel等，2015)。单细胞核酸测序已经揭示了多种生物学问题，例如检测新的癌症细胞类型(Gr
ü/>n等，2015)，鉴定基因调控机制(Datlinger等，2017)，研究发育过程的动态(Li等，2017)以及揭示癌症中的免疫细胞概况(Zheng等，2017)。高通量单细胞测序不仅可以分析相同表型的遗传异质性，还可以从那些通常难以培养的细胞中获得遗传信息。
[0004]两种流行的单细胞测序方法是基于平板的方案和基于微滴的方法。基于平板的方案如SMART
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Seq2(Picelli等，2013；Picelli等，2014；Tang等，2009)在基因检测中有较高的灵敏度，但为个体细胞构建测序文库成本高昂。相应地，基于微滴的方法如Drop
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seq(Klein等，2015和Macosko等，2015)、10xGenomics Chromium和Biorad ddSEQ通过为大量细胞建立条码化文库，以相对较低的成本并行地分析大量细胞，测序效率更高。这些方法通常在同一液滴中分离单细胞和多个独特的条形码，以每个细胞为基础构建条码化文库。这种类型的方案仍然需要将个体细胞分隔成具有不同标识符(如条形码)的不同隔室，且通常依赖于液滴发生器来创建作为隔室的液滴。
[0005]本专利技术提供了细胞内单细胞核酸捕获方法，它是胞内核酸条码化反应，使用个体细胞本身作为隔室并将多个独特的标识符(如条形码)递送进入细胞，无需额外的隔室化，直接捕获细胞中的遗传信息。它显著简化了单细胞实验设置，并消除了对外部隔室生成的需要。带有细胞内捕获的靶向测序能够显著增强对于极低频率突变检测的灵敏度和特异性，例如在癌症发展的很早期鉴定体细胞突变，这是早期癌症检测所需要的。

技术实现思路

[0006]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的条件下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条形码模板进入细胞之前，或在转染克隆条形码模板进入细胞的同时，或在转染克隆条形码模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
[0007]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条形码模板进入细胞之前，或在转染克隆条形码模板进入细胞的同时，或在转染克隆条形码模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。在细胞中加入转座体(transpososome)，在细胞内的RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
[0008]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供微粒上多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条码化微粒转染到细胞中，其中微粒上的条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条码化模板进入细胞之前，或在转染克隆条码化模板进入细胞的同时，或在转染克隆条码化模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
[0009]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供微粒上多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条码化微粒转染到细胞中，其中微粒上的条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条码化模板进入细胞之前，或在转染克隆条码化模板进入细胞的同时，或在转染克隆条码化模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。在细胞中加入转座体，在细胞内的RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
[0010]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板和多个细胞。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与细胞内的核酸杂交。本方法进一步包括裂解转染的细胞而不从杂交的核酸中分离条形码模板，提供逆转录酶并使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
[0011]一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板和多个细胞。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与细胞内的核酸杂交。本方法进一步包括裂解转染的细胞而不从杂交的核酸中分离条形码模板，提供逆转录酶并使用条形码模板作为引物合成互补DNA。向反应中加入转座体，直接在RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
[0012]在一个方面，本文所述的是利用胞内条码化核酸进行使用模板转换方法或使用一般第二链cDNA合成方法(如用RNA酶H/DNA聚合酶/DNA连接酶组合)的第二链cDNA合成的方法。
[0013]一方面，本文所述的是利用胞内条码化核酸制备测序文库用于单细胞表达谱分析(single cell expression profiling)、单细胞靶向测序和免疫组库分析(immune repertoire analysis)的方法。
[0014]一方面，本文所述的是检测早期癌症的方法。本方法包括提供独立细胞形式的测
试样本，条码化胞内核酸以生成带细胞条形码标签的互补DNA，使用互补DNA生成涵盖含有一个或多个致瘤变体(tumorigenic variant)和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于无隔室化胞内条码化靶标的方法，其包括：a.提供条形码模板；b.提供细胞；c.将所述条形码模板转染到所述细胞内；其中当所述细胞在多个其他细胞之间时，所述细胞没有通过分区与所述其他细胞分隔开，且其中所述条形码模板在所述细胞内捕获胞内靶标；d.在所述细胞内生成衍生自所述被捕获的胞内靶标或在所述细胞被裂解后衍生自所述被捕获的胞内靶标的核酸序列，且其中所述核酸序列被附接到来自所述条形码模板的条形码序列或互补序列；以及e.基于相附接的所述条形码序列的存在，鉴定所述来自所述细胞的核酸序列和/或其互补序列；且其中另一个具有所述相同条形码序列的核酸序列与同一细胞相关。2.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板是在多个条形码模板之间，且它们被固定在微粒上；其中所述微粒尺寸在约100nm至约100μm之间；且其中所述多个条形码模板彼此是克隆的。3.如权利要求2所述的方法，其中所述微粒大小为1μm至20μm。4.如权利要求2所述的方法，其中，所述微粒是磁性的或可降解的。5.如权利要求2所述的方法，其中所述微粒在多个微粒中；其中多个微粒中的一个群体是非条码化的，多个微粒中的另一个群体包括条形码模板；其中所述两个群体是混合的；以及其中具有条形码模板的微粒群体中的所述条形码模板相对于每个微粒来说是克隆的。6.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板是非固定化的。7.如权利要求6所述的方法，其中所述非固定化的条形码模板被封装在脂质体或液滴中；其中在每个脂质体或每个液滴中，条形码模板相对于所述脂质体或所述液滴中的另一个条码模板而言是克隆的。8.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括所述条形码模板的约10个或更多的拷贝。9.如权利要求8所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括约10,000个或更多的拷贝。10.如权利要求9所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括约10,000,000个或更多的拷贝。11.如权利要求1所述的方法，其中在微粒上或在脂质体或液滴内，所述条形码模板相对于条形码模板群体中的另一个条形码模板是克隆的；并且其中在所述微粒上或在所述脂质体或所述液滴内存在超过一个条形码模板群体。12.如权利要求1所述的方法，其中在微粒上或在脂质体或液滴内，存在超过一个条形码模板群体，其中所述条形码模板的第一群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第一群体是克隆的；而所述条形码模板的第二群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第二群体是相同的。13.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板在多个条形码模板之间，而所述细胞在多个细胞中；其中所述条形码模板与细胞的比例是这样的：当所述条形码模板被转染到所述细胞中时，少于约30％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过
约70％的所述转染细胞包括一个或更少的条形码模板克隆群体。14.如权利要求1所述的方法，其中当所述条形码模板被转染进所述细胞时，少于约20％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约80％的所述转染细胞包含一个或更少的条形码模板克隆群体。15.如权利要求1所述的方法，其中当所述条形码模板被转染进所述细胞时，少于约10％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约90％的所述转染细胞包含一个或更少的条形码模板克隆群体。16.如权利要求1所述的方法，其中在所述细胞内，多个条形码模板的超过一个群体是在所述细胞内的；并且其中每个条形码模板群体内的所述条形码模板是克隆的。17.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板包含条形码序列，以及至少一个衔接子，其能够引发、杂交、扩增、链转移或其组合。18.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板的一个克隆包括UMI序列。19.如权利要求17所述的方法，其中所述衔接子选自下组：多聚
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T序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宙涛，D，
申请(专利权)人：通用测序技术公司，
类型：发明
国别省市：