一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法技术

提供了一种特定的把多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能(A9 mDA)神经细胞的方法。分化形成成熟A9 mDA神经元，可表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括TH，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1，和GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CB。所述A9 mDA神经细胞移植到黑质，其轴突可特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区

【技术实现步骤摘要】
一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法


[0001]本专利技术属于神经干细胞科学领域，更具体地，本专利技术涉及多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能神经细胞的分化方法。

技术介绍

[0002]帕金森病(Parkinson
’
s disease,PD)是一种长期的中枢神经系统退行性疾病，平均发病年龄60岁，在65岁以上老人中发病率是1.7％。国际流行病学调查显示，2005年中国PD患者约200万，占全球发病人数的一半。预期到2030年，中国将有接近500万PD患者。帕金森病的患者常表现为运动障碍，如静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势不稳等等。帕金森病的病理基础是中脑黒质多巴胺能神经元的退行性变和丢失，造成了纹状体多巴胺能水平显著下降，从而导致了运动功能的障碍。
[0003]多巴胺能神经元因能够分泌儿茶酚胺类神经递质多巴胺而得名，在脑内有广泛的分布。多巴胺能神经元以酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)为标志物，TH是多巴胺合成的限速酶，负责催化酪氨酸转变成L-多巴(L-DOPA)。在中脑，多巴胺能神经元主要分布在三个核团：黒质致密区(the substantia nigrapars compacta，SNc)、腹侧被盖区(the ventral tegmental area，VTA)和红核后区(the retrorubral field，RrF)。SNc的多巴胺能神经元也被称为A9 mDA神经元，VTA的则称为A10 mDA神经元，RrF的为A8 mDA神经元，A8-10的命名是依据解剖学的定位区分的。A9 mDA神经元和A10 mDA神经元是中脑多巴胺能神经元(midbrain dopaminergic neurons,mDA)中两种重要的亚型，两类神经元除了位置分布的不同，投射环路也各不相同。A9 mDA神经元主要投射到背外侧纹状体，组成中脑黒质纹状体通路，主要调控运动功能，是帕金森氏病中特异性丢失的多巴胺能神经元亚群。A10 mDA神经元主要投射到伏隔核、皮层、嗅皮层、杏仁核等，组成中脑边缘皮层通路，参与调控奖赏、情绪等功能。
[0004]A9 mDA神经元和A10 mDA神经元在帕金森病中表现出不同的易感性。在帕金森病人脑内，SNc的A9 mDA神经元优先退化，SNc腹侧的细胞较背侧更为敏感，而相邻的VTA中的A10 mDA神经元则相对幸免。细胞内钙结合蛋白calbindin(CALB)被作为A10 mDA神经元的标志物，calbindin是被用来区分PD病人及PD模型动物脑内多巴胺能神经元中具有拮抗能力的神经元，大都是A10 mDA神经元。而另一种蛋白，G-蛋白门控内向整流钾通道 (GIRK)，它通过激活D2或GABA受体，产生一个缓慢的抑制性突触后电位，从而来调控多巴胺能神经元的活性。其中，GIRK2特异地在易感的多巴胺能神经元(大都是A9 mDA神经元)中表达。
[0005]临床上尚无治愈帕金森病的有效治疗方案，目前应用的治疗手段只能改善症状，却不能阻止病情的进展。药物治疗是帕金森病最主要的治疗手段，通过补充多巴胺或者增强多巴胺受体功能来达到治疗的效果，左旋多巴 (L-DOPA)制剂仍是最有效的药物，然而药物只在PD早期阶段有效，随着多巴胺能神经元的进一步丢失，药物逐渐失效并出现明显的副作用。脑深部电刺激术也被应用于帕金森病人的治疗。但与药物治疗一样，手术治疗仅能改善症状，并不能根治疾病。而且由于深部脑刺激的副作用，这一治疗手段只适用于部分病
人。通过外源移植多巴胺能神经元，进而替代脑内丢失的多巴胺能神经元的功能(干细胞治疗)，是具有前景的治疗方法之一。临床实验发现，移植流产胎儿中脑腹侧(中脑多巴胺能神经前体细胞所在脑区)的细胞到病人的纹状体，部分病人的运动功能可以得到长期恢复，并且不需要或只需少量使用药物。移植的神经前体细胞部分可以分化成DA神经元，并释放DA[16, 17]。这些临床研究证明了干细胞治疗在PD治疗中的巨大潜能。然而流产胎儿脑组织来源有限，且存在伦理学问题。人多能干细胞(hPSCs)，包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导性多能干细胞(hiPSCs)，具有分化为全身所有类型细胞的潜能，是获得各类功能细胞用于治疗的理想细胞来源。遵循体内发育的原则，人多能干细胞可以诱导分化成为中脑多巴胺能神经元。这些细胞移植入PD模型鼠纹状体内，可以存活，并能够挽救帕金森的行为表现，给帕金森病的治疗带来了新的希望。
[0006]然而，在这些研究中都没有明确区分移植细胞中中脑多巴胺能神经元的亚型(A9/A10)。如上所述内源不同亚型的多巴胺能神经元其电生理特性，支配的脑区和生理功能完全不同。因此迫切需要开发针对中脑多巴胺能神经元不同亚型的分化方法，尤其是针对帕金森氏病的细胞治疗，需要开发高效的中脑黒质多巴胺能神经元富集的分化方法。并且对于分化得到的多巴胺能神经元需要从多个层面，包括标志物分子的表达，电生理特征，轴突投射的特征等验证其亚型特异性。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种特定的把多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，以及由该方法获得的细胞或细胞制剂。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供一种制备中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，包括：(1)将干细胞置于包含神经诱导剂的培养基中，在多阶段中以添加组分分别进行诱导；以及，(2)从培养物中获得所述干细胞来源的中脑黑质多巴胺能神经细胞。
[0009]在一个优选例中，(1)中，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导：第一阶段：添加SB431542，DMH-1，SHH和CHIR99021；第二阶段：添加SAG， SHH和CHIR99021；第三阶段：添加SHH，SAG和FGF8b；第四阶段：添加 SHH和FGF8b。
[0010]在另一优选例中，第一阶段中，添加1～15μM(如2，5，8，12，14μM) SB431542，1～5μM(如0.4，0.6，1，3，5，10，15，18μM)DMH-1，200～ 1000ng/mL(如300，400，600，700，800，900ng/mL)的SHH，0.1～1μM(如 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9μM)的CHIR99021。
[0011]在更优选的优选例中，第一阶段中，添加10
±
5μM的SB431542，2
±
1μM 的DMH-1，添加500
±
200ng/ml的SHH，0.4
±
0.2μM的CHIR99021。进一步优选地，添加10
±
2μM的SB431542，2
±
0.5μM的DMH-1，添加500
±
100 ng/ml的SHH，0.4
±
0.1μM的CHIR99021。
[0012]在另一优选例中，第二阶段中，添加0.1～5μM(如0.2，0.5，0.8，1，2， 3，4μM)的SAG，50～300ng/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，包括：(1)将干细胞置于包含神经诱导剂的培养基中，在多阶段中以添加组分分别进行诱导；以及(2)从培养物中获得所述干细胞来源的中脑黑质多巴胺能神经细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导：第一阶段：添加SB431542，DMH-1，SHH和CHIR99021；第二阶段：添加SAG，SHH和CHIR99021；第三阶段：添加SHH，SAG和FGF8b；第四阶段：添加SHH和FGF8b。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导时：第一阶段：添加1～15μM DMH-1，200～1000ng/mL的SHH，0.1～1μM的CHIR99021；第二阶段：添加0.1～5μM的SAG，50～300ng/ml的SHH，0.1～1μM的CHIR99021；第三阶段：添加5～100ng/ml的SHH，0.1～5μM的SAG，5～200ng/ml的FGF8b；第四阶段：添加5～100ng/ml的SHH，5～80ng/ml的FGF8b。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导时：第一阶段：添加10
±
5μM的SB431542，2
±
1μM的DMH-1，添加500
±
200ng/ml的SHH，0.4
±
0.2μM的CHIR99021；第二阶段：添加2
±
1μM的SAG，100
±
50ng/ml的SHH，0.4
±
0.2μM的CHIR99021；第三阶段：添加20
±
10ng/ml的SHH和0.5
±
0.2μM的SAG，100
±
50ng/ml的FGF8b；第四阶段：添加20
±
10ng/ml的SHH，20
±
10ng/ml的FGF8b。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，各阶段中，第一阶段：培养起始至培养6～8天；较佳地7
±
0.5天；第二阶段：培养6～8天至培养11～13天；较佳地12
±
0.5天；第三阶段：培养11～13天至培养18～20天；较佳地19
±
0.5天；第四阶段：培养18～20天至培养31～33天；较佳地32
±
0.5天。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞包括：胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；较佳地，所述干细胞为人干细胞，所述胚胎干细胞或诱导性多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞。7.一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得。8.一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞在分化5～10天后，表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括酪氨酸羟化酶，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1和/或GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB。9.如权利要求7或8所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞移植到脑的黑质区后，移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元轴突特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区-背侧纹状体；和/或移植后分化获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈跃军，周文浩，熊曼，
申请(专利权)人：上海跃赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：