可结合人乳头瘤病毒的抗体20F6及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可结合人乳头瘤病毒的抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个CDR区，序列分别如SEQ ID NO:3

【技术实现步骤摘要】
可结合人乳头瘤病毒的抗体20F6及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可特异性结合HPV病毒的单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是世界范围内一组极为常见的病毒。是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的宿主特异性，只有人类会被HPV感染。两种类型的人乳头瘤病毒(16型和18型)引起70％的宫颈癌和宫颈癌前病变。几乎所有宫颈癌病例都是由人乳头瘤病毒感染导致。全球每年宫颈癌的新发病例为52.8万。在中国大陆已上市三种HPV疫苗(二价、四价和九价)，均可用于预防高危型HPV，但目前接种率仍较低，部分个体即使接种疫苗仍无抗病毒抗体产生，且疫苗不能治疗已获人乳头瘤病毒感染或宫颈癌等与人乳头瘤病毒有关的疾病。
[0003]目前，临床上尚无直接针对HPV的特异性治疗药物，主要通过物理治疗及干扰素等辅助治疗，难以彻底清除体内病毒，易于复发。因此，需要研发出专门针对HPV病毒的抗体，作为宫颈癌等与HPV感染有关的疾病的治疗药物。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过用抗原免疫Balb/c小鼠，获取单克隆抗体，可特异性结合人乳头瘤病毒。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合人乳头瘤病毒的抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括三个CDR区，序列分别如SEQ ID NO:3
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5；所述轻链可变区包括三个CDR区，序列分别如SEQ ID NO:6
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>8所示。
[0005]在一个具体实施方案中，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。尽管本实施方案提供了带有骨架区序列的重链可变区序列和轻链可变区序列，但是本领域技术人员应当清楚，抗体对抗原的结合取决于重链可变区的CDR序列和轻链可变区的CDR序列，本领域技术人员在知晓本专利技术提供的重链可变区CDR序列和轻链可变区的CDR序列之后，可通过结合不同的骨架区序列来获得不同的重链可变区和轻链可变区，进而组合成不同的重链和轻链，这些变化都包含在本专利技术的保护范围之下。
[0006]本专利技术还提供了上述抗体在制备人乳头瘤病毒检测剂中的应用，所述人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58中的一种或多种组合。
[0007]在一个具体实施方案中，所述检测剂为ELISA检测剂或免疫荧光检测剂。
[0008]本专利技术还提供了上述抗体在制备人乳头瘤病毒感染治疗药物中的应用，所述人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58中的一种或多种组合。
[0009]本专利技术还提供了编码上述抗体的核酸。
[0010]本专利技术还提供了上述核酸在制备用于HPV感染的治疗或预防药物中的应用。
[0011]在一个具体实施方案中，所述HPV感染为HPV16感染。
[0012]可使用上述核酸搭载到例如AAV等表达载体中，制备成基因治疗药物，注射至人体
内，用于治疗HPV感染。
[0013]本专利技术针对高危病毒HPV16进行中和抗体药物开发，通过制备HPV16 VLP、免疫Balb/c小鼠、利用电融合技术平台等，筛选到特异性结合包括HPV16、HPV18在内的多种HPV亚型的单克隆抗体，并鉴定了其序列。本专利技术为HPV感染的临床诊断和治疗提供潜在的抗体新药。
附图说明
[0014]图1为3免后小鼠抗血清效价检测曲线；
[0015]图2为融合后杂交瘤克隆上清以HPV16 VLP进行ELISA初筛的结果汇总图；
[0016]图3为单克隆抗体20F6的分型统计图；
[0017]图4为单克隆抗体20F6与9个HPV亚型VLP蛋白ELISA反应性的统计图；
[0018]图5为单克隆抗体20F6与9个亚型胞内HPV VLP颗粒结合的荧光显微镜照片；
[0019]图6为单克隆抗体20F6与9个高危亚型HPV假病毒的中和反应活性检测结果图；
[0020]图7为不同浓度的单克隆抗体50A11及20F6对HPV16假病毒中和活性的浓度
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抑制率曲线；
[0021]图8为单克隆抗体20F6与HPV16 VLP蛋白的亲和力检测图。
具体实施方式
[0022]1.免疫原的制备
[0023]我们应用HPV16 VLP包装载体,转染293TT细胞后，裂解细胞，成熟、包装并纯化得到HPV16 VLP。
[0024]2.小鼠免疫与抗血清的获得
[0025]用50μg HPV16 VLP蛋白与50μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对6
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8周龄Balb/c小鼠进行初免，在第21天、42天用25μg HPV16 VLP蛋白与50μl弗氏不完全佐剂加强免疫2次，第2次加强免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第2次加强免疫3周后进行冲击免疫，腹腔注射50μg HPV16 VLP，3天后，取小鼠脾脏进行杂交瘤电融合。
[0026]抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.2μg/ml的HPV16 VLP蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前小鼠血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti
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mouse IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4
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6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
[0027]结果如图1所示，3免后2只小鼠血清效价均≥7.29X105,可见该抗原可诱导小鼠产生特异性针对HPV16 VLP蛋白的高滴度抗血清。
[0028]3.杂交瘤的制备
[0029]取效价相对高的M3号小鼠，经腹腔注射50μg HPV16 VLP进行冲击免疫，3天后，取小鼠脾脏细胞进行杂交瘤电融合。在无菌环境下，取小鼠脾脏，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，制成脾细胞悬液后与SP2/O细胞按照2：1比例混合，以电融合缓冲液洗涤后重悬于电融合缓冲液中。电融合完毕，静置5分钟后轻缓收集细胞于DMEM完全培养基中静置于37
℃。10min后离心，500rpm室温离心5分钟，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)轻轻重悬细胞，将细胞铺于96孔板中，每孔200μL。
[0030]4.筛选分泌抗HPV16 VLP单克隆抗体的杂交瘤细胞
[0031]融合后第7天，用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞。筛选结果如图2所示。选择OD较高的阳性克隆进行特异性检测及亚克隆化，并用梯度稀释法及有限稀释法连续克隆化2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可结合人乳头瘤病毒的抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括三个CDR区，序列分别如SEQ ID NO:3
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5；所述轻链可变区包括三个CDR区，序列分别如SEQ ID NO:6
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8所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1或2所述的抗体在制备人乳头瘤病毒检测剂中的应用，所述人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，吴喜林，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：