一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法技术

本发明专利技术属于食品防腐技术领域，公开了一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法，本发明专利技术通过分子生物学的方法，构建基因敲除株

【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法


[0001]本专利技术涉及食品防腐
，更具体地，涉及一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法。

技术介绍

[0002]真菌细胞中，TORC1可感知环境中的营养物质、生长因子、压力等信号，来参与调节蛋白质翻译、核糖体合成、基因转录等信号通路，进而调节真菌的生长及代谢。上游响应元件Gtr1与Gtr2结合为异源二聚体，可介导上游多个信号通路，进而通过下游效应器调控细胞的生理过程，而下游支路中，Sch9与Tap42作为代谢效应元件，可响应上级通路传导的信号因子并通过下游调控镰孢菌的生长代谢。但Gtr1、Gtr2、Sch9与Tap42单一元件由TORC1通路介导对菌丝生长及次生代谢物生成的调控作用，目前还未有报道。
[0003]氨基酸作为TORC1信号通路的激活因子，具有显著调控细胞功能的作用。氨基酸根据性质的不同，可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、支链氨基酸、含硫氨基酸等。在不同种类的氨基酸激活下，可通过真菌TORC1元件传达不同的响应信号，对特定氨基酸进行响应，并通过下游支路的协同作用吸收有利于生长代谢。但目前对不同种类的氨基酸如何调控镰孢菌的生长与代谢，还没有深入研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了克服现有技术中存在的上述缺陷，首先提供了氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供上述方法在食品防腐的应用。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0008]氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用，所述氨基酸自酸性氨基酸和含硫氨基酸。
[0009]优选的，所述氨基酸选自L
‑
Asp、L
‑
Cys、L
‑
Glu、L
‑
Met中的至少一种。
[0010]本专利技术还提供一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，包括以下步骤：
[0011]S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株
△
FoGtr2和尖孢镰孢菌基因回补株
△
FoGtr2
‑
C；
[0012]S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株
△
FoGtr2和基因回补株
△
FoGtr2
‑
C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L
‑
Asp、L
‑
Cys、L
‑
Glu、L
‑
Met中的至少一种。
[0013]优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株
△
FoGtr2的构建方法包括以下步骤：
[0014](1)、以质粒pBluescript KS(+
‑
)(pBS)
‑
HPH1为模板，PCR扩增HYG抗性基因，将PCR产物纯化后连接T载体，得到重组质粒HYG
‑
T，并测序验证；
[0015](5)、以HYG为目标基因设计正向引物和反向引物，以重组质粒HYG
‑
T为模板，扩增得到HYG的融合片段，扩增Gtr2基因的左右同源臂，通过重叠PCR连接T载体；
[0016](6)、按照Split
‑
marker重组技术成功构建Gtr2的敲除结构；
[0017](7)、通过原生质体转化，将Gtr2的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞，转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。
[0018]优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株
△
FoGtr2
‑
C的构建方法包括以下步骤：
[0019](1)、以连接Gtr2基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Gtr2基因；PCR产物经过纯化后，连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300
‑
neo上，并测序进行验证；
[0020](2)、基因回补载体向农杆菌的转化：向农杆菌中加入质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；
[0021](3)、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀，涂布于硝酸纤维素膜上培养3d；
[0022](4)、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；
[0023](5)、培养的菌落进行测序验证。
[0024]优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长和/或产孢能力和/或产毒能力。
[0025]更优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指同时抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力；所述氨基酸为L
‑
Asp和/或L
‑
Cys。
[0026]本专利技术还提供上述方法在食品防腐中的应用。本领域技术人员知道，尖孢镰孢菌在鱼干、虾干等水产干制品中广泛存在，对水产干制品造成了一定程度的危害，因此，可以使用上述方法用于防控水产干制品中尖孢镰孢菌的爆发。
[0027]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0028]本专利技术通过分子生物学的方法，构建基因敲除株
△
FoGtr2和基因回补株
△
FoGtr2
‑
C，经向野生株、以及构建的基因敲除株
△
FoGtr2和基因回补株
△
FoGtr2
‑
C中添加不同种类的氨基酸，发现含硫氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而可用于未来食品的防腐保鲜。
附图说明
[0029]图1为Gtr2敲除转化子中HYG基因的PCR验证(a)和Gtr2敲除转化子25
‑
6的PCR验证(b)；(a)：M:DNA分子标记，1.转化子25
‑
5；2.转化子25
‑
6；3.转化子25
‑
7；4.转化子25
‑
8；5转化子22
‑
14；6.转化子22
‑
15；7.转化子22
‑
16；8.转化子22
‑
17.(b)：M，DNA Markers；1.以Gtr2转化子25
‑
6菌丝DNA为模板，扩增Gtr2
‑5’‑
HY；2.以Gtr2转化子25
‑
6菌丝DNA为模板，扩增Gtr2
‑3’‑
YG；
[0030]图2为尖孢镰孢菌Gtr2基因扩增的PCR验证M：DNA分子标记；2：Gtr2基因的PCR验证；
[0031]图3为Gtr2基因敲除菌株基因回补的PCR验证；M：DNA分子标记；1
‑
8：分别以Gtr2基因回补的尖孢镰孢菌1<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用，其特征在于，所述氨基酸选自酸性氨基酸和含硫氨基酸。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸选自L
‑
Asp、L
‑
Cys、L
‑
Glu、L
‑
Met中的至少一种。3.一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株
△
FoGtr2和尖孢镰孢菌基因回补株
△
FoGtr2
‑
C；S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株
△
FoGtr2和基因回补株
△
FoGtr2
‑
C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L
‑
Asp、L
‑
Cys、L
‑
Glu、L
‑
Met中的至少一种。4.根据权利要求3所述的氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株
△
FoGtr2的构建方法包括以下步骤：(1)、以质粒pBluescript KS(+
‑
)(pBS)
‑
HPH1为模板，PCR扩增HYG抗性基因，将PCR产物纯化后连接T载体，得到重组质粒HYG
‑
T，并测序验证；(2)、以HYG为目标基因设计正向引物和反向引物，以重组质粒HYG
‑
T为模板，扩增得到HYG的融合片段，扩增Gtr2基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙力军，邓义佳，房志家，邓旗，王雅玲，王润东，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：