基于纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组建库方法及应用技术

本发明专利技术属于基因测序领域，具体涉及一种纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组建库方法。针对纳米孔测序平台通量低、临床样本宿主含量高和总RNA中包含大量核糖体RNA问题，通过反向富集等，对临床样本进行不完全宿主细胞DNA去除以及核糖体RNA去除；针对临床样本病毒载量低以及RNA病毒基因组多样性高问题，采用单引物等温扩增等主动正向富集cDNA。本发明专利技术通过正、反向富集步骤，成功搭建了纳米孔测序平台RNA病毒宏转录组建库检测流程，满足了临床对于未知RNA病毒病原体的快速鉴定，适用于推广应用。适用于推广应用。适用于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
基于纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组建库方法及应用


[0001]本专利技术属于基因测序领域，具体涉及一种纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组建库方法及应用。

技术介绍

[0002]感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因，一直备受临床关注。在大多数严重的感染病例中，RNA病毒是主要病原体，如季节性流感的全球大流行以及新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)的全世界范围大流行，给世界经济和人类健康带来严峻挑战，让病原的精准快速鉴定成为关注的热点。
[0003]传统临床微生物实验室鉴定病毒的主要方法是病毒的分离培养、免疫荧光检测和 PCR分子检测等技术，但其存在局限性。病毒的分离培养和免疫荧光检测敏感性低且费时；PCR分子检测只依据临床医师鉴别诊断针对特定病原体类型，罕见及新型病毒病原体的检测能力有限。而RNA病毒的宏转录组测序可以全面、无偏向性地检出样本中的RNA 病毒，发现传统手段无法检测到的罕见和新型病原体，为临床决策提供更全面精确的参考。此外，RNA病毒的宏转录组测序可以进一步研究病毒和宿主的免疫应答，为寻找疾病标志物提供可能，推动感染病精准诊疗的发展。
[0004]宏基因组测序鉴定相较于传统病原学鉴别方法，具有鉴定周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势。而且宏基因组测序克服了传统的病原学诊断即临床医生根据患者的临床表现做出的一系列鉴别诊断，被越来越多地应用于微生物，特别是不明原因病原微生物的鉴定中。但是现有的基于二代测序技术，测序分析周期长、读长短、仪器投入大，这限制了其在临床快检中应用的可行性。三代测序技术PacBio在测序读长方面有了很大提高，但其建库流程较为复杂，且同二代测序一样存在测序周期长的缺点，需要几十个小时完成数据下机，加上后续分析时间，很难满足临床快速鉴定。
[0005]近年来发展起来的纳米孔测序技术可以弥补其他测序平台的劣势，其测序超长序列读长、实时数据产生和生信分析、设备小巧便携的特点，具有提高病原微生物检测的准确性、缩短报告周期的特点，并适合医院及现场检测，契合临床感染诊断的需求场景，有希望成为下一代的感染诊断技术。
[0006]RNA病毒宏转录组的研究领域，临床样本宿主核酸量极高，总RNA中包含大量核糖体RNA(简称，rRNA)且样本中病毒载量极低，RNA病毒Reads检测不到或者检测到的数量非常少，RNA病毒宏转录组建库成为挑战。实践中，针对感染病精准诊疗，急需一种高效、便捷的关于RNA病毒的宏转录组建库方法。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]针对临床样本RNA病毒检出困难的问题，本专利技术拟解决的核心问题或目的是搭建一套纳米孔测序平台RNA病毒宏转录组建库的检测流程，以提高纳米孔测序平台RNA 病毒
检测的灵敏度，满足了临床对于怀疑RNA病毒感染的样本快速检测需求，适用于推广应用。
[0009]本专利技术通过以上反向富集和正向富集的操作步骤，成功搭建了纳米孔测序平台RNA 病毒宏转录组建库的检测流程，提高了RNA病毒宏转录组检测的灵敏度，满足了临床对于未知病原的快速鉴定，适用于推广应用。
[0010]具体的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0011]本专利技术首先提供一种基于纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组建库方法，包括如下步骤：
[0012]1)样本去宿主DNA步骤；
[0013]2)核酸提取步骤；
[0014]3)cDNA合成步骤；
[0015]4)cDNA富集步骤；
[0016]5)人源rRNA剔除步骤；
[0017]进一步的，还可包括：
[0018]6)文库建库步骤。
[0019]进一步的，所述1)样本去除宿主DNA步骤为不完全去除宿主DNA步骤。
[0020]更进一步的，所述步骤1)中，采用DNase对样本进行不完全去除宿主DNA；
[0021]优选的，所述DNase添加量为26U～260U,可实现对应临床样本有效的不完全去宿主。
[0022]进一步的，所述2)核酸提取步骤可采用采用Zymo_D7021或Qiagen_57704进行 RNA病毒提取；优选的，采用Zymo
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D7021。
[0023]进一步的，所述4)cDNA富集步骤采用单引物等温扩增法主动富集cDNA；
[0024]更进一步的，所述单引物等温扩增法为SPIA等温扩增法主动富集cDNA。
[0025]优选的，所述SPIA等温扩增采用NuGEN Trio RNA
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Seq(Single PrimerIsothermal Amplification)试剂盒。
[0026]进一步的，所述5)采用探针法去除人源rRNA。
[0027]进一步的，所述探针法包括杂交捕获步骤和特异性核酸酶处理步骤。
[0028]优选的，所述杂交捕获可采用NuGEN Trio RNA
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Seq(transcript depletion withAnyDeplete)试剂盒。
[0029]进一步的，所述6)文库构建步骤采用PCR
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free建库上机试剂盒；更优选的，采用SQK
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LSK109试剂盒。
[0030]进一步的，所述样本包括但不限于：体液样本、肺泡灌洗液样本、痰液样本、脑脊液样本。
[0031]进一步的，所述RNA病毒宏转录组是基于纳米孔测序平台的RNA病毒宏转录组。
[0032]本专利技术还提供上述任一方法在RNA病毒宏转录组测序中的应用。
[0033]本专利技术的有益技术效果：
[0034](1)本专利技术对临床样本宿主含量高和总RNA中包含大量核糖体RNA(rRNA)，通过反向富集，对临床样本进行不完全宿主细胞DNA去除以及rRNA去除。
[0035](2)本专利技术针对临床样本病毒载量低以及RNA病毒基因组多样性高，采用单引物等温扩增法主动富集cDNA。
[0036](3)本专利技术通过反向富集和正向富集，有效提高了RNA病毒宏转录组检测的灵敏度，满足了临床对于未知病原的鉴定，适用于推广应用。
[0037](4)本专利技术对整个流程进行详细的参数优化，获得一套适于纳米孔测序平台的、用于RNA病毒宏转录组建库和测序分析的方法流程。
附图说明
[0038]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0039]图1本专利技术的实验流程如图；
[0040]图2不同上机建库试剂盒病毒每千条Reads检出结果比较图；
[0041]图3不同上机建库试剂盒测序平均覆盖深度检出结果比较图；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA病毒宏转录组建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)样本去宿主DNA步骤；2)核酸提取步骤；3)cDNA合成步骤；4)cDNA富集步骤；5)人源rRNA剔除步骤；优选的，还包括：6)文库构建步骤。2.权利要求1所述的RNA病毒宏转录组建库方法，其特征在于，所述1)样本去除宿主DNA步骤为不完全去除宿主DNA步骤。3.权利要求2所述的RNA病毒宏转录组建库方法，其特征在于，所述步骤1)中，采用DNase对样本进行不完全去除宿主DNA；优选的，所述DNase添加量为26U
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260U,实现对应临床样本有效的不完全去宿主。4.权利要求1
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3任一所述的RNA病毒宏转录组建库方法，其特征在于，所述4)cDNA富集步骤采用单引物等温扩增法主动富集cDNA；优选的，所述单引物等温扩增法为SPIA等温扩增法。5.权利要求1
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4任一所述的RNA病毒宏转录组建库方法，其特征在于，所述5)采用探针法去除人源rRNA。优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周水莲，潘吾思，戴岩，李振，童桢开，李诗濛，任用，
申请(专利权)人：江苏先声诊断技术有限公司江苏先声诊断医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：