一种酰胺化合物生物传感器的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酰胺化合物生物传感器的构建及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一段AmiC

【技术实现步骤摘要】
一种酰胺化合物生物传感器的构建及其应用


[0001]本专利技术涉及一种酰胺化合物生物传感器的构建及其应用，具体涉及一种酰胺类物质生物传感器(AmiC
‑
AmiR)氨基酸序列以及表达该传感器所用的RBS、含有编码该氨基酸序列的基因的质粒、转化后含有该质粒的菌株及其在改善酰胺类化合物传感器上的应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]酰胺是一类含氮的羧酸衍生物，在构造上，酰胺可看作是羧酸分子中羧基的羟基被氨基或烃氨基(
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NHR或
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NR2)取代而成的化合物；也可看作是氨或胺分子中氮原子上的氢被酰基取代而成的化合物。主要用作工业溶剂，医药工业上用于生产维生素、激素，也用于制造杀虫脒。丙烯酰胺(Acrylamide)，是一种十分重要的化合物。在工业中，是一种有广泛应用的化工原料，可以用作合成高分子材料的原料，其聚合物具有良好的絮凝、降阻、增稠等特性，可以用作隧道挖掘、石油开采、土壤改良和工业防腐等；在人类健康方面，是一个具有亲电基团的有机小分子，水溶性极强，容易存在于过度烹饪的食物之中，被人体吸收后存在于体内各组织之中，对肌体造成损害。
[0003]生物传感器(biosensor)，是一种可以快速响应环境中的目标物质并将其浓度转化为便于辨认的信号，如电信号、颜色等，人们可以根据接收到的信号来判断目标物质的有无以及含量的多少。
[0004]丙烯酰胺作为一种无色、无臭的化合物，溶于溶剂中之后很难检测，目前最常用的检测手段就是高效液相色谱，但是这种方法成本比较高，而且耗费时间。此外丙烯酰胺的检测还可以使用比色法，但是这种方法易受其他物质干扰，灵敏度比较低，误差比较严重。同时，其他的酰胺类化合物也和丙烯酰胺存在着同样的问题，检测难度大、对检测的浓度要求高。因此目前还缺少一种可以从复杂环境中高效、准确的检测酰胺类化合物、尤其是丙稀酰胺的手段。

技术实现思路

[0005]针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种来源于铜绿假单胞菌的(Pseudomonas aeruginosa)的转录调节因子AmiC
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AmiR的氨基酸基序及其在检测丙烯酰胺的应用。
[0006]本专利技术提供了一种生物传感器，所述生物传感器由转录调节因子AmiC和AmiR组成，所述AmiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第83位进行取代。
[0007]在一种实施方式中，所述AmiR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]在一种实施方式中，AmiC和AmiR的RBS序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009]本专利技术提供了一种生物检测系统，所述生物检测系统为向宿主细胞中转入所述生
物传感器，构建得到重组菌。
[0010]在一种实施方式中，以质粒pVEO为表达载体，所述表达载体上含有AmiC、AmiR和与AmiR结合的抗终止子。
[0011]在一种实施方式中，所述AmiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第83位进行取代。
[0012]在一种实施方式中，在一种实施方式中，所述AmiR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]在一种实施方式中，AmiC和AmiR的RBS序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0014]在一种实施方式中，AmiR结合的抗终止子的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0015]在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主细胞。
[0016]本专利技术提供了一种检测酰胺类物质含量的方法，所述方法是利用所述生物检测系统进行检测，具体为将重组菌在目的体系中培养，培养后再检测荧光值。
[0017]在一种实施方式中，所述目的体系中酰胺类物质的含量为0～4mM。
[0018]在一种实施方式中，将重组菌在30～40℃、150～200rpm条件下培养7～8h得到种子液，将种子液按1％～5％的比例添加至目的体系中培养20～30h。
[0019]本专利技术提供了所述生物传感器或所述生物检测系统在检测酰胺类化合物或腈类化合物或酸类化合物中的应用。
[0020]在一种实施方式中，所述酰胺类化合物包括乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺；所述腈类化合物包括丙烯腈；所述酸类化合物包括丙烯酸。
[0021]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一段AmiC
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AmiR突变体的氨基酸基序，为了能在宿主中正常行使功能优化后的RBS的基因序列。同时，进一步说明了上述AmiC
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AmiR的AmiC结构单元上的83号位突变形成的突变体(Y83H)及其酶的定向进化和检测丙烯酰胺的方面的应用。AmiC
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AmiR的突变体Y83H相较与野生型对与丙烯酰胺的响应能力从不响应变为响应，经过RBS的优化使其响应能力达到了微摩尔级别，响应范围在0～10mM之间。说明上述氨基酸残基对于AmiC
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AmiR的响应配体的改变具有重要作用，并且对于进一步深入认识和理解AmiC
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AmiR的改造和响应配体具有重要意义。
附图说明
[0022]图1野生型AmiC
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AmiR的RBS的优化建库部分结果。
[0023]图2为野生型与突变体对于不同物质的特异性检验。
[0024]图3为Y83H对于不同浓度丙烯酰胺的响应验证。
具体实施方式
[0025]表1引物序列
[0026][0027](注：F代指上游引物，R代指下游引物)
[0028]表2 PCR扩增体系
[0029][0030][0031]实施例1：野生型AmiC
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AmiR的构建
[0032]从NCBI下载来源于铜绿假单胞菌的(Pseudomonas aeruginosa)的转录调节因子AmiC
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AmiR的氨基酸基序，在金唯智进行基因合成并进行密码子优化，然后将合成好的基因与实验室已有的质粒pVEO(pVEO是在pET24a基础上使用Pveg启动子代替了T7启动子，并在启动子之后插入了GFP基因)采用吉普森组装法(Gibson Assembly)组装的方法构建了质粒pVEO
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AmiC
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AmiR
‑
WT，然后将与AmiR结合的抗终止子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)采用全质粒PCR的方法整合到构建好的质粒上。
[0033]具体步骤为：
[0034]首先使用引物(AmiC
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R_insert
‑
S
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R、AmiC
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R_insert
‑
S
‑
F)以质粒p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物传感器，其特征在于，由转录调节因子AmiC和AmiR组成，所述AmiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第83位进行取代。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述AmiR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，AmiC和AmiR的RBS序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.一种生物检测系统，其特征在于，向宿主细胞中转入权利要求1～3任一所述生物传感器，构建得到重组菌。5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，以质粒pVEO为表达载体，所述表达载体上含有AmiC、AmiR和与AmiR结合的抗终止子。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，程中一，来乾朋，韩来闯，崔文璟，刘中美，周丽，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：