检测变体核酸的解链温度方法、试剂盒和报告寡核苷酸技术

本发明专利技术涉及用于检测包含目的核苷酸的靶核酸序列中变体序列的存在、特别是用于检测微卫星不稳定性的基于解链分析的方法。所述方法采用探针作为具有荧光团和猝灭剂的报告寡核苷酸，并且其中所述核苷酸序列包含具有疏水嵌入残基的核苷酸。还公开用于确定药物的功效以及用于预测个体中临床障碍的存在的方法，以及用于进行所述方法的报告寡核苷酸和试剂盒。用于进行所述方法的报告寡核苷酸和试剂盒。用于进行所述方法的报告寡核苷酸和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测变体核酸的解链温度方法、试剂盒和报告寡核苷酸


[0001]本专利技术涉及用于检测包含目的核苷酸的靶核酸序列中变体序列的存在、特别是检测种系和体细胞突变以及微卫星不稳定性的方法。还公开用于预测药物功效以及用于检测个体中临床障碍的存在的方法，以及用于进行所述方法的报告寡核苷酸和试剂盒。

技术介绍

[0002]可遗传的(种系)或不可遗传的(体细胞)突变事件，如单一核苷酸取代、缺失、插入、易位和重复，对人体生物学发挥工具性影响。基因图谱的确定揭示关于对环境因素(如运动和饮食)的反应以及在疾病诊断、预后和适用的治疗方案中的信息。遗传评价通常用像DNA测序或等位基因特异性PCR的工具来进行。涉及分子探针的可变结合的方法适用于种系变异，但是在与像HRM的技术组合时也适用于低等位基因频率体细胞突变。
[0003]在许多生物体中观察到重复性核苷酸序列(如同向或反向重复序列)。作为例子，成百上千的微卫星基因座分布于整个人基因组中，并且因此，在统计学上以约每100,000个碱基对一次出现。微卫星基因座是基因组DNA中包括短串联重复序列的区域，在所述短串联重复序列中，最短的重复性单元的长度通常为一至五个核苷酸。因此，如果适用，一般将特定微卫星基因座的重复性单元称为单、二、三、四或五核苷酸重复基因座。给定的微卫星基因座通常包括呈串联排列的约10与40个之间的这些重复性单元。此外，大多数二倍体物种的正常基因组DNA的每个微卫星基因座(如来自哺乳动物物种的基因组DNA)在每个基因座处包括两个等位基因。所述两个等位基因的长度可以彼此相同或不同，并且可以在个体间变化。
[0004]微卫星不稳定性(MSI)或复制错误(RER)是在某些人肿瘤中出现的基因组不稳定性的例子，在所述肿瘤中肿瘤细胞准确复制其DNA的能力减小。MSI是人DNA错配修复(MMR)基因的潜在功能失活的常见标记。MMR基因的功能丧失被认为是由于双等位基因失活而发生，所述双等位基因失活是通过编码区突变、杂合性丢失(LOH)和/或启动子甲基化来进行。此外，已知MMR基因的种系突变是大多数遗传性非息肉病结肠癌(HNPCC)家族中的常染色体线性遗传缺陷。HNPCC个体中由肿瘤突变引发的其他突变导致特定MMR基因的双等位基因失活，从而引起肿瘤中微卫星DNA的准确复制的丧失。因此，MSI是潜在DNA错配修复缺陷的标记，并且也与编码DNA中增强的突变率相关。除了导致MSI以外，这种源自MMR缺陷的增变基因表型在同向重复序列处以相等频率引起编码区碱基取代和移码突变二者。MMR缺陷的生成和所得增变基因表型被认为是肿瘤发生中的早期事件。
[0005]MSI不仅与HNPCC家族中的种系缺陷有关，还在约15％至20％的散发性结直肠癌中发现了MSI，其中所述发现也反映了基因组不稳定性(也测量为肿瘤突变负荷)的总体增加。肿瘤中MSI缺陷的发现还与分期匹配肿瘤的更好预后相关。因此，在临床上相关的是，鉴定具有MSI的肿瘤不仅暗示种系MMR缺陷(HNPCC家族)，而且用于预后分层。尽管临床(Bethesda指南(Rodriguez
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Bigas等人,1997)和组织病理学特征可能引起如下怀疑：结直肠肿瘤是微卫星不稳定的并且可能在HNPCC家族中出现，但临床病理学特征通常不足以诊
断MSI的存在。因此，可以利用分子测试来阐明临床上怀疑的肿瘤的MSI状态(Boland等人,1998)。
[0006]除了结直肠肿瘤外，MSI还与其他类型的癌症和其他遗传障碍相关。为了说明，这些癌症和遗传障碍尤其包括胰腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、子宫癌和乳腺癌。被认为与微卫星不稳定性有关的其他示例性遗传障碍包括例如亨廷顿病(HD)、齿状核
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红核
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苍白球
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丘脑下部萎缩(DRPLA)、脊髓延髓和肌萎缩(SBMA)、强直性肌营养不良(DM)、脆性X综合征、FRAXE精神发育迟缓和脊髓小脑共济失调(SCA)、布鲁顿X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、布卢姆综合征(BS)、颅额鼻综合征(CFNS)和特发性肺纤维化(IPF)。
[0007]根据上文清楚，对变体核苷酸序列(例如重复性核苷酸序列，如微卫星)的分析尤其具有许多诊断和预后应用。因此需要灵敏的、客观的且可靠的测定。

技术实现思路

[0008]本专利技术如权利要求中所限定。本文所述的方法代表一种用于研究种系和体细胞突变以及微卫星不稳定性的快速、容易、无偏且灵敏的方法。
[0009]本文提供一种用于检测由两条链组成并且包含优选地含有重复序列的一个或多个目的核苷酸(NOI)的靶核酸序列中变体序列的存在的方法，其中所述靶核酸序列由变体序列组成或由参考序列组成，所述方法包括以下步骤：
[0010]a)提供第一样品，其包含怀疑含有所述变体序列的核酸；
[0011]b)提供第二样品，其包含含有所述参考序列的核酸，其中所述第二样品是参考样品；
[0012]c)提供报告寡核苷酸；
[0013]d)提供引物组，其由第一引物和第二引物组成，其中所述引物组一起能够扩增包含所述NOI的所述靶核酸序列；
[0014]e)在所述第一样品、所述第一引物和所述第二引物的存在下扩增所述靶核酸序列，从而获得包含怀疑含有变体序列的核酸的第一扩增子；并且在所述第二样品、所述第一引物和所述第二引物的存在下扩增所述靶核酸序列，从而获得包含所述参考序列的第二扩增子，其中所述第二扩增子是参考扩增子；
[0015]f)进行所述第一扩增子的解链分析，如高分辨率解链(HRM)分析，从而获得特征为第一解链曲线的第一图谱，并且进行所述第二扩增子的解链分析，如HRM分析，从而获得特征为第二解链曲线的第二图谱，其中所述第二图谱是特征为参考解链曲线的参考图谱；其中每个扩增子包含第一链和第二链，其中所述解链分析涉及所述报告寡核苷酸与每个扩增子的一条链的杂交、对荧光团发射的信号的检测以及获得所述第一和所述第二解链曲线；
[0016]其中所述报告寡核苷酸是范围为10至50个核苷酸、优选地范围为15至50个核苷酸的序列，在其中已经插入范围为2至10个的疏水核苷酸，
[0017]其中所述报告寡核苷酸包含优选地在其5'端或距5'端4个核苷酸内的第一荧光团以及优选地在其3'端或距3'端4个核苷酸内的第一猝灭剂，并且
[0018]其中所述报告寡核苷酸包含杂交序列H，
[0019]其中所述杂交序列与所述靶核酸序列中第一链的序列的连续延伸段相同，并且其中所述杂交序列与所述靶核酸序列中第二链的序列的连续延伸段互补，
[0020]并且其中所述报告寡核苷酸的杂交序列包含重复性序列和在其5'端和/或在其3'端的至少一个辅助序列或由所述重复性序列和辅助序列组成，其中所述辅助序列不包含重复序列，并且能够在所述杂交序列与所述第一和所述第二扩增子杂交时与所述扩增子杂交；以及
[0021]g)将所述第一图谱与所述参考图谱进行比较，其中所述第一图谱与所述参考图谱之间的差异表明，所述第一样品含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测由两条链组成并且包含优选地含有重复序列的一个或多个目的核苷酸(NOI)的靶核酸序列中变体序列的存在的方法，其中所述靶核酸序列由变体序列组成或由参考序列组成，所述方法包括以下步骤：a)提供第一样品，其包含怀疑含有所述变体序列的核酸；b)提供第二样品，其包含含有所述参考序列的核酸，其中所述第二样品是参考样品；c)提供报告寡核苷酸；d)提供引物组，其由第一引物和第二引物组成，其中所述引物组一起能够扩增包含所述NOI的所述靶核酸序列；e)在所述第一样品、所述第一引物和所述第二引物的存在下扩增所述靶核酸序列，从而获得包含怀疑含有变体序列的核酸的第一扩增子；并且在所述第二样品、所述第一引物和所述第二引物的存在下扩增所述靶核酸序列，从而获得包含所述参考序列的第二扩增子，其中所述第二扩增子是参考扩增子；f)进行所述第一扩增子的解链分析，如高分辨率解链(HRM)分析，从而获得特征为第一解链曲线的第一图谱，并且进行所述第二扩增子的解链分析，如HRM分析，从而获得特征为第二解链曲线的第二图谱，其中所述第二图谱是特征为参考解链曲线的参考图谱；其中每个扩增子包含第一链和第二链，其中所述解链分析涉及所述报告寡核苷酸与每个扩增子的一条链的杂交、对荧光团发射的信号的检测以及获得所述第一和所述第二解链曲线；其中所述报告寡核苷酸是范围为10至50个核苷酸、优选地范围为15至50个核苷酸的序列，在其中已经插入范围为2至10个的疏水核苷酸，其中所述报告寡核苷酸包含优选地在其5'端或距5'端4个核苷酸内的第一荧光团以及优选地在其3'端或距3'端4个核苷酸内的第一猝灭剂，并且其中所述报告寡核苷酸包含杂交序列H，其中所述杂交序列与所述靶核酸序列中第一链的序列的连续延伸段相同，并且其中所述杂交序列与所述靶核酸序列中第二链的序列的连续延伸段互补，并且其中所述报告寡核苷酸的杂交序列包含重复性序列和在其5'端和/或在其3'端的至少一个辅助序列或由所述重复性序列和辅助序列组成，其中所述辅助序列不包含重复序列，并且能够在所述杂交序列与所述第一和所述第二扩增子杂交时与所述扩增子杂交；以及g)将所述第一图谱与所述参考图谱进行比较，其中所述第一图谱与所述参考图谱之间的差异表明，所述第一样品含有变体序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤g)包括以下步骤或由以下步骤组成：i)将所述第一和所述第二解链曲线在给定荧光强度下沿温度轴对齐，从而消除所述第一与所述第二解链曲线之间的解链温度差异；ii)确定在所述第一与所述第二解链曲线之间由所述荧光团发射的信号的差异，优选地其中所述差异是数值差异；以及iii)将在ii)中确定的所述差异与阈值进行比较，其中差异大于所述阈值表明，所述第一样品包含变体序列，并且差异小于所述阈值表明，所述第一样品包含所述参考序列。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参考序列的长度为15个或更多个核苷酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告寡核苷酸由重复性序列和在
其5'端或其3'端的仅一个辅助序列组成，或者其中所述报告寡核苷酸由重复性序列和两个辅助序列组成，所述两个辅助序列例如在所述报告寡核苷酸的5'端和3'端两端的一个辅助序列。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个疏水核苷酸定位于所述报告寡核苷酸的5'端或距5'端10个核苷酸内；和/或至少一个疏水核苷酸定位于所述报告寡核苷酸的3'端或距3'端10个核苷酸内；并且其中所述疏水核苷酸具有以下结构X
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Y
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Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或者能够被掺入核酸或核酸类似物的骨架中的骨架单体单元，Q是不参与沃森
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克里克氢键合的嵌入剂；并且Y是连接所述核苷酸或核苷酸类似物或骨架单体单元与所述嵌入剂的接头部分。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述辅助序列包含1至20个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，或由所述核苷酸组成。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述辅助序列包含如权利要求3中所定义的至少一个疏水寡核苷酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将如权利要求3中所定义的至少一个疏水核苷酸如1、2或3个疏水核苷酸插入距所述报告寡核苷酸的3'端1至10个核苷酸内，如距3'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将如权利要求3中所定义的至少一个疏水核苷酸如1、2或3个疏水核苷酸插入距所述报告寡核苷酸的5'端1至10个核苷酸内，如距5'端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤e)中的扩增是通过聚合酶链反应(PCR)进行，优选地通过不对称PCR进行，其中所述第一和所述第二引物以不同量来提供，从而引导所述PCR以扩增每个扩增子的一条链多于每个扩增子的另一条链。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一样品已经从患有或怀疑患有疾病或障碍的个体分离，所述疾病例如癌症，优选地所述癌症是遗传性非息肉病结直肠癌，所述障碍优选地是与微卫星不稳定性相关的障碍。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NOI是微卫星，如总长度为n个核苷酸的M个串联重复序列的微卫星序列，并且其中所述变体序列具有总长度为n'个核苷酸的M'个串联重复序列，其中M和M'是不同的整数。13.根据权利要求12所述的方法，其中n是15或更大，如16、17、18、19、20、...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：潘塔贝斯公司，
类型：发明
国别省市：