一种表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了一种表达CTLA

【技术实现步骤摘要】
一种表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物。

技术介绍

[0002]细胞毒T淋巴细胞相关抗原(4cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)又名CD152，是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的T细胞，与T细胞表面的协同刺激分子受体(CD28)具有高度的同源性，共同享有B7分子配体(B7-1/CD80，B7-2/CD86)，而CTLA-4与B7分子结合后能负下调T细胞的反应活性，参与免疫反应的负向调节，因此是一种免疫共抑制分子。其机制，一是与CD28竞争性的结合B7或者招募磷酸酶到CTLA-4的胞内结构域部分从而降解T细胞受体(TCR)和CD28的信号，二是降低CD80/CD86在APC的表达水平或者通过转胞吞作用将它们从APC上移除，这样就减少了CD28参与激活T细胞。此外，CTLA-4还会介导树突细胞结合CD80/CD86并诱导色氨酸降解酶IDO的表达，从而导致TCR的抑制。伴随外源性抗原或肿瘤特异性靶抗原的刺激，T细胞被激活，CTLA-4表达水平上升抑制T细胞的免疫反应。因此阻断CTLA-4的免疫效应可刺激T细胞增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。基因重组的CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。/>[0003]干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。
[0004]目前，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但
使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
[0005]为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。
[0006]此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术所存在的不足，本专利技术的第一个目的，在于提供一种可表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物。
[0008]本专利技术的第二个目的，在于提供一种免疫兼容的表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物
[0009]本专利技术的第三个目的，在于提供一种免疫兼容可逆的表达CTLA-4阻遏分子的多能干细胞或其衍生物。
[0010]本专利技术的第四个目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在制备CTLA-4高表达肿瘤治疗药物中的应用。
[0011]本专利技术的第五个目的，在于提供一种制剂，包含上述多能干细胞或其衍生物。
[0012]本专利技术所采取的技术方案是：
[0013]本专利技术的第一个方面：提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有CTLA-4阻遏分子的表达序列。
[0014]所述CTLA-4阻遏分子为抗CTLA-4抗体，优选为人源化的封闭抗体。
[0015]本专利技术的第二个方面：提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有CTLA-4阻遏分子的表达序列；所述CTLA-4阻遏分子为抗CTLA-4抗体，优选为人源化的封闭抗体。
[0016]所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。
[0017]本专利技术的第三个方面：提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍
生物的基因组中导入有CTLA-4阻遏分子的表达序列；所述CTLA-4阻遏分子为抗CTLA-4抗体，优选为人源化的封闭抗体。
[0018]所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有CTLA-4阻遏分子的表达序列。2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述CTLA-4阻遏分子为抗CTLA-4抗体，优选为人源化的封闭抗体。3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。4.根据权利要求1或2所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。6.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。7.根据权利要求6所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5中的至少一种；所述CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15中的至少一种；所述HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的至少一种；所述HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.24中的至少一种；所述HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.30中的至少一种；所述HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的至少一种；所述HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.45中的至少一种；
所述HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47中的至少一种；所述HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.57中的至少一种；所述HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.66中的至少一种；所述HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.73中的至少一种；所述HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.74～SEQ ID NO.83中的至少一种；所述HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.93中的至少一种；所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，莫健，杨建国，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：