长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用，属于海洋生物技术领域。长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，为anti

【技术实现步骤摘要】
长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于海洋生物
，具体涉及长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，以及该多克隆抗体的制备方法和用途。

技术介绍

[0002]脊椎动物的生长是由下丘脑
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垂体组成的生长轴起核心调控作用。在下丘脑生长激素释放激素（growth hormone releasing factor, GHRH）和生长抑素（somatostatin, SS）的双重作用下，由垂体生长激素分泌细胞（Somatotropes）分泌生长激素（growth hormone, GH）。GH由循环系统到达肝脏，诱导胰岛素（insulin）和胰岛素样生长因子（insulin
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like growth factor, IGF）的表达。Insulin/IGF分别与各自的靶细胞表面受体结合，介导GH的生长调节作用。但是，在牡蛎等无脊椎动物中，没有脑和垂体等结构，它们的生长是如何被调控的，迄今为止，在无脊椎动物中并未发现任何与脊椎动物同源的GH及其受体基因，以及GH相关的调控因子，但发现了胰岛素样肽，胰岛素样肽受体及其结合蛋白等，它们在无脊椎动物的生长调节，能量稳态中发挥了重要的作用。在前期的研究中，我们通过广泛的多组学数据挖掘，在长牡蛎基因组中发现了四种胰岛素样肽基因，包括ILP、MIRP3、MIRP3
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like和ILP7。研究发现它们主要在神经丰富的组织以及营养物质消化吸收相关的组织中表达，并且其表达水平与长牡蛎的生长速度呈正相关。除此之外，在食物缺乏、低温等不适于生长的环境条件下，这四种胰岛素样肽基因的表达均受到不同程度的影响，表明胰岛素样肽作为一种重要的神经肽在长牡蛎的生长中发挥了重要的作用。神经肽是神经元分泌的细胞间信号分子，常作为激素、神经递质和调制器发挥作用，它们作为神经元活动的调节因子，在调节生长、新陈代谢、生殖等各种生理过程中起着关键作用。在软体动物中，胰岛素样肽的分泌与调控机制尚不明确。要研究这一问题，首先需要对长牡蛎胰岛素样肽蛋白进行准确的定位。然而，目前市面上只有针对高等动物的胰岛素特异性抗体，由于种属差异性，此类抗体对软体动物胰岛素样肽不具有特异性，不能准确识别长牡蛎胰岛素样肽蛋白。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体及其制备方法，本专利技术的另一目的在于长牡蛎四种胰岛素样肽特异性多克隆抗体（anti
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ILP，anti
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MIRP3，anti
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MIRP3
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like，anti
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ILP7）的具体应用。
[0004]为了上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体由pET32a
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ILP，pET32a
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MIRP3，pET32a
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MIRP3
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like，pET32a
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ILP7重组质粒诱导表达的抗原蛋白免疫小鼠获得。
[0005]用于制备长牡蛎四种胰岛素样肽抗体的抗原表位，所述四种胰岛素样肽抗体为anti
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ILP，anti
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MIRP3，anti
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MIRP3
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like，anti
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ILP7，其对应的抗原表位分别为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，上述氨基酸序列的表达质粒后，经诱
导表达、纯化获得抗原蛋白。
[0006]含有上述抗原多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为表达质粒与宿主菌，所述表达质粒为pET32a
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ILP，pET32a
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MIRP3，pET32a
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MIRP3
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like，pET32a
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ILP7，宿主菌为包含上述重组质粒的BL21（DE3）表达菌株。
[0007]所述四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：S1. 预测四种胰岛素样肽的信号肽，去除信号肽序列后，再分析四种胰岛素样肽剩余氨基酸序列的抗原性；S2. 构建重组质粒：分别针对各胰岛素样肽，设计一对特异性引物以扩增抗原片段，将扩增后的抗原片段与原核表达载体pET32a进行连接，分别构建pET32a
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ILP，pET32a
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MIRP3，pET32a
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MIRP3
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like，pET32a
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ILP7重组质粒；S3. 将上述四种重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，对重组蛋白进行纯化；S4. 将重组蛋白进行乳化后，对小鼠采用皮下注射，并进行四次免疫；S5. 收集、分离得到含有抗体的小鼠血清，采用抗原亲和层析方法纯化血清，即得到四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体。
[0008]上述四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体能够用于长牡蛎胰岛素样肽分泌细胞的定位，及长牡蛎神经内分泌调控网络的构建。
[0009]本专利技术的优点和有益效果：本专利技术通过构建重组表达质粒，诱导表达重组蛋白，将重组蛋白作为抗原免疫小鼠，进而获得特异的针对长牡蛎四种胰岛素样肽的多克隆抗体。本专利技术提供的长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体具有特异性强，灵敏度高等优点，可满足免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等实验要求。
[0010]本专利技术为建立体外免疫分析、研究长牡蛎胰岛素样肽的生理功能提供了基础。本专利技术在长牡蛎胰岛素样肽蛋白的表达与定位中具有重要的应用前景，也为揭示长牡蛎胰岛素样肽分泌细胞与其它神经神经递质分泌细胞之间的空间位置关系提供技术支持，为构建长牡蛎神经内分泌调控网络奠定了基础。
附图说明
[0011]图1为长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白诱导表达及纯化结果。
[0012]图2为长牡蛎四种胰岛素样肽重组蛋白特异性His单抗验证结果。
[0013]图3为长牡蛎四种胰岛素样肽抗体Western blot特异性检测结果。
[0014]图4为长牡蛎四种胰岛素样肽在各组织的免疫组化分析结果。
[0015]图5为长牡蛎四种胰岛素样肽与5
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羟色胺（5
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HT）在神经节中共定位结果。
[0016]图6为长牡蛎四种胰岛素样肽与多巴胺在神经节中共定位结果。
具体实施方式
[0017]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做
出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1四种胰岛素样肽蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1. 利用S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.长牡蛎四种胰岛素样肽多克隆抗体，其特征在于，该四种胰岛素样肽多克隆抗体为anti
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ILP、anti
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MIRP3、anti
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MIRP3
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like和anti
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ILP7；anti
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ILP对应的抗原表位为SEQ ID NO.1所示，anti
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MIRP3对应的抗原表位为SEQ ID NO.2所示，anti
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MIRP3
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like对应的抗原表位为SEQ ID NO.3所示，anti
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ILP7对应的抗原表位为SEQ ID NO.4所示。2.含有权利要求1所述的抗原表位的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达质粒与宿主菌；所述表达质粒为通过将抗原表位片段与原核表达载体pET32a进行连接构建，宿主菌为包含所述表达质粒的BL21表达菌株。3.所述四种胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士凯，李永婧，李琪，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：