一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由cortland溶液和Hank

【技术实现步骤摘要】
一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法。

技术介绍

[0002]黄鳍鲷隶属于鲷科，棘鲷属，是一种具有广盐度适应能力的海水鱼类，主要分布于东南亚近岸海鱼及河口湾；在繁殖季节，黄鳍鲷从生活的低盐度浅海区域向高盐度海域迁移进行产卵。黄鳍鲷是天然雌雄同体鱼类：1龄黄鳍鲷的性别为全雄，1龄雄性在繁殖期过后，其精巢逐渐退化，卵巢开始发育，发育至2龄的黄鳍鲷为雌雄同体，可以产生精子，但是卵子发育不成熟；部分3龄黄鳍鲷性完全反转为雌性，可以产生成熟的卵子。
[0003]黄鳍鲷因肉质鲜美、营养价值较高、口感佳，颇受市场欢迎，并在我国东南沿海等地区被广泛养殖。近年来，黄鳍鲷养殖规模逐渐增大，养殖户对优质黄鳍鲷种苗需求增多，海捕黄鳍鲷种苗的数量难以满足需求，且其质量参差不齐，因此，培育优质黄鳍鲷新品种对提高养殖效率和社会经济效益具有重要意义。然而，如前文所述，黄鳍鲷亲本成熟时间长、亲本成熟时间不一致，造成黄鳍鲷优良品种培育较为困难。因此，冷冻保存黄鳍鲷优良种质资源，应用于人工繁殖，对于培育优良黄鳍鲷新品种具有重要意义。
[0004]种质资源通常指胚胎、胚胎干细胞和种质细胞即生殖细胞，是物种或者种群繁衍的基础。在大多数有性生殖动物中，生殖细胞经过减数分裂产生精子和卵子，精卵结合后形成受精卵进而产生新的个体。大多数鱼类胚胎为离体发育，早期发育所需的能量来自于成熟卵子携带的大量卵黄和蛋白等营养物质物质。对于种质资源的保存，由于鱼类成熟的卵子较大不利于渗透和平衡，且其含有的大量卵黄和蛋白质等物质在冷冻和其他脂类物质难以被渗透和平衡，在冻融过程中容易失活，因此，鱼类卵子的冷冻保存较为困难。而精子在成熟过程中，会逐渐将大部分的细胞质内含物清除，成熟的精子具有体积小、数量多和内含物质相对简单等特点，因此精子是保存鱼类种质资源的优良选择。
[0005]目前，低温冻存技术已初步应用于冻存一些海水鱼类的精子，如虹鳟、红鼓鱼和俄罗斯鲟鱼等。对于精子的低温冻存技术，精子冷冻保存液是冷冻保存精子的关键。现有技术中，上述鱼类的精子冷冻保存液会通过各种盐离子形成一个近似于生理状态的溶液环境，来短暂维持精子正常生理状态；并且上述的精子冷冻保存液中通过加入抗冻剂（甘油、DMSO和甲醇等）和非渗透性防冻剂或者营养物质（脱脂奶粉、卵黄、蛋白质和糖类等）来保护精子在温度剧烈变化过程中保持其内部结构的完整性和活力。
[0006]关于黄鳍鲷精子，超微结构显示，其头部呈圆形或卵圆形，头部无明显的顶体结构，植入窝位于细胞核底端的中间，中心粒复合体位于植入窝内，其中近端中心粒位于植入窝的上段，基体位于植入窝的下段；袖套位于核后端，两侧分布有线粒体和囊泡；尾部细长，其主要结构是轴丝，轴丝为典型的“9 +2”微管结构。
[0007]作为一种天然由雄性向雌性性反转的海水鱼类，黄鳍鲷与哺乳动物以及一些其他海水鱼类在精子的生理结构上存在显著差异。首先，与哺乳动物相比，黄鳍鲷没有典型的顶
体结构；与天然由雌性向雄性性反转的海水鱼类斜带石斑鱼相比，黄鳍鲷精子的质膜和核膜之间没有较大的空隙和少量的囊泡，也不像金鱼精子核膜和质膜之间存在着许多液泡；与鲤鱼精子的植入窝位于细胞核的一侧以及大黄鱼精子的植入窝位于细胞核背面不同，黄鳍鲷与日本鳗鲡、平鲷和黄颡鱼的精子植入窝类似，都是从核的后端向前端陷入核中形成“井”状；黄鳍鲷精子的细胞质膜与袖套膜不相连，不同于日本鳗鲡精子；黄鳍鲷精子尾部除轴丝外，未发现其他明显结构，不存在如平鲷、红鳍东方鲀等精子尾部的侧鳍结构，也没有大黄鱼精子尾部的篓状结构。如前文所述，黄鳍鲷与哺乳动物和许多鱼类的精子的生理结构存在明显差异，因此，现有的鱼类精子冷冻保存液对于黄鳍鲷精子不是最适宜的，不能保证其在冷冻保存后有较高存活率和活力。因此，需要针对黄鳍鲷精子的特性开发其精子冷冻保存液。

技术实现思路

[0008]本专利技术的第一目的在于提供一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，在现有鱼类精子冷冻保存溶液的基础上进行优化和改良，保证黄鳍鲷精子在冷冻保存后的具有较高存活率和活力。
[0009]本专利技术的第二目的在于提供一种利用所述冷冻保存溶液的黄鳍鲷精子冷冻保存方法。
[0010]为实现上述的第一目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由cortland溶液和Hank
’
s溶液混合而成，以确保黄鳍鲷精子获得较高的活力；所述营养物质包括蔗糖和海藻糖；所述抗氧化剂包括牛血清白蛋白（BSA）、褪黑素和维生素E；所述抗冻保护剂为二甲亚砜（DMSO）。
[0011]具体地，上述的cortland溶液包括以下组分：氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D
‑
葡萄糖和七水硫酸镁；Hank
’
s溶液包括以下组分：氯化钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、二水氯化钙、六水氯化镁、D
‑
葡萄糖和七水硫酸镁。
[0012]专利技术人在研究现有的鱼类精子冷冻保存液对黄鳍鲷精子进行冷冻保存时发现，冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率不高，而且活力低；其中发现，在精液冷冻保存前的降温平衡阶段，因呼吸作用，精子会产生大量的活性氧而导致精子质膜损伤，影响黄鳍鲷精子冷冻保存效果。
[0013]因此，本专利技术将抗氧化剂组分引入到黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液中；然后经过大量的实验，专利技术人获得牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E的抗氧化剂组合，其用于黄鳍鲷精子的冷冻保存，显著提高了冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。
[0014]其中，褪黑素是首次应用于鱼类的精子冷冻保存溶液中；此前，有研究表明，在公牛中，添加褪黑素可以显著提高直线运动精子的比例，提升精子活力，增加精浆总蛋白、白蛋白浓度和胆固醇，且降低天冬氨酸转氨酶活性；在仓鼠中，褪黑素能显著促进精子超活化，进而增强精子的体外受精能力；因此，在现有技术中褪黑素可以作为一种抗氧化剂用于冷冻保存液，保护哺乳动物精子。然而，与哺乳动物不同，大多数鱼类精子（包括黄鳍鲷精子）没有顶体结构，而且其精子头部内含物等生理结构也与哺乳动物精子有明显的差别，因此，哺乳动物精子的冷冻保存液不适用于鱼类精子的冻存。
[0015]但是，专利技术人经过大量研究，将褪黑素添加到黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液中进行实验，证实了褪黑素能够应用于黄鳍鲷精子冷冻保存液中，并有效提高冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。
[0016]而且，专利技术人也创新地将维生素E用于黄鳍鲷精子冷冻保存液中，其和褪黑素配合，显著提高冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。
[0017]此外，专利技术人在研究黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液过程中，考虑到不同鱼类的精子最佳活力的pH值存在差异，如虹鳟的精子活力和受精率在pH值为9.0时最高，大比目鱼和花鲈的精子分别在pH值为7.5
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8.5和pH值为9.0时活力最高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由cortland溶液和Hank
’
s溶液混合而成；所述营养物质包括蔗糖和海藻糖；所述抗氧化剂包括牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E；所述抗冻保护剂为二甲亚砜。2.根据权利要求1所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：精子基础稀释液中，Cortland溶液和Hank
’
s溶液的体积比为2:1~1:3。3.根据权利要求2所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：Cortland溶液和Hank
’
s溶液的体积比为1:2。4.根据权利要求2或3所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：以精子基础稀释液为基准，牛血清白蛋白的质量百分比添加量为1~3%，褪黑素的添加量为1~100微摩尔，维生素E的添加量为1~10微摩尔。5.根据权利要求4所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：牛血清白蛋白的质量百分比添加量为2%，褪黑素的添加量为10微摩尔，维生素E的添加量为5微摩尔。6.根据权利要求5所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：以精子基础稀释液为基准，海藻糖的添加量为35.0~45.0g/L，蔗糖的添加量为6~7g/L；二甲亚砜的质量百分比添加量为5%~15%。7.根据权利要求6所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：海藻糖和蔗糖的添加量分别为38.7g/L、6.85g/L；二...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，易梅生，张勇，汤明玥，董梦丹，张晋，李水生，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：