一种堆肥产品中抗性基因环境健康风险评估的方法技术

一种堆肥产品中抗性基因环境健康风险的评估方法，所述的方法包括：采集堆肥鲜样和土壤样品，提取堆肥与土壤水溶性有机质，将携带抗性基因质粒与水溶性有机质混合，随后加入感受态E.coliDH5α混匀，培养一段时间后再在含有AMP抗生素的固体培养基与一般固体培养基上稀释涂布，培养后，取平板并计数，根据计数结果计算抗性基因转移频率；再根据堆肥与土壤样品的转移频率计算抗性基因环境风险阈值，用于评估堆肥中抗性基因环境健康风险。本发明专利技术从抗性基因水平转移的全新角度来评估堆肥产品中抗性基因的环境健康风险，相较于传统的直接检测抗性基因丰度，本发明专利技术的评估方法更精准，为堆肥产品风险评估提供了有力支撑。肥产品风险评估提供了有力支撑。肥产品风险评估提供了有力支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种堆肥产品中抗性基因环境健康风险评估的方法


[0001]本专利技术属于生物
和环境保护领域，具体涉及到一种堆肥产品中抗性基因环境健康风险的评估方法。

技术介绍

[0002]堆肥是一种固废有机资源再利用的有效手段，减少有机固废污染的同时，回收利用有机废物中可利用的有机质。但有机固废中所含的残留抗生素，重金属，有机污染物和消毒剂等会诱导抗性基因的产生。堆肥技术能够削减抗性基因(Huang et al.,2021，Environmental effects and risk control of antibiotic resistance genes in the organic solid waste aerobic composting system:A review.Frontiers of Environmental Science&Engineering,15(6),127.)，从而控制有机固废的环境健康风险。而抗性基因能够在微生物间发生水平转移，如果耐药菌获取水平转移的抗性基因(Nolivos et al.,2019，Role of AcrAB
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TolC multidrug efflux pump in drug
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resistance acquisition by plasmid transfer.Science,364(6442),778
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782.)，其环境风险更高。而目前，抗性基因的环境风险仅通过丰度高低初步判断，评估方式对于不环境风险并不是精准的。因此缺乏一种准确评估堆肥产品中抗性基因环境风险的方法。为更精确判断堆肥产品中抗性基因的环境健康风险，寻找一种能够准确、便捷可行的堆肥抗性基因环境健康风险的评估方法是十分必要的。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种堆肥产品中抗性基因的环境健康风险评估方法，以期准确、便捷的不同类型、不同阶段堆肥产品的环境健康风险。
[0004]为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种堆肥产品中抗性基因的环境健康风险评估方法，其步骤包括：
[0005]取堆肥产品鲜样，提取堆肥有机质；
[0006]将上述堆肥有机质与携带抗性基因质粒混匀培育得到混合液；
[0007]向混合液中加入感受态大肠杆菌混匀后，培养得到培养液；
[0008]分别制备无抗生素的固体培养基和相应抗生素的固体培养基，并将培养液分别在所述的两种类型固体培养基平板上涂布培养；
[0009]分别对培养后的两种类型的固体培养基平板上的菌落进行计数，得到菌落个数；并按下述公式计算抗性基因水平转移频率P
堆肥产品
：
[0010][0011]其中N
AMP
表示相应抗生素的固体培养基上菌落个数；其中N
LB
表示无抗生素的固体培养基上菌落个数；
[0012]对土壤样品同样按上述方法进行处理，得到两种类型的固体培养基平板上的菌落个数，并按同样的公式计算土壤样品抗性基因转移频率P
土壤样品
；
[0013]根据下述公式计算抗性基因水平转移风险阈值，评估堆肥产品抗性基因环境健康风险：
[0014][0015]在具体实施方式中，所述堆肥产品或土壤样品有机质的提取方法如下：按照质量比堆肥产品或土壤样品1g：5
‑
15ml超纯水，进行震荡20
‑
28h，离心4000
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6000rpm，取上清液过滤膜提取。优选地，其中震荡的时间为24h，离心为5000rpm，取上清液过0.22μm滤膜提取。
[0016]在一个具体实施方式中，所述携带抗性基因质粒是pUC19；所述相应抗生素是氨苄青霉素，即相应抗生素的固体培养基中添加氨苄青霉素。
[0017]在一个优选实施方式中，所述大肠杆菌E.coli DH5α。
[0018]在一个具体实施方式中，向混合液中加入感受态大肠杆菌混匀是在混合液中加入感受态大肠杆菌后，充分混匀后先冰浴20
‑
40min，随后在40
‑
45℃中摇匀60
‑
120s，再在冰浴中降温2
‑
4min；所述培养得到培养液是于37℃，震荡培养。优选地，向混合液中加入感受态大肠杆菌混匀是在混合液中加入感受态大肠杆菌后，充分混匀后先冰浴30min，随后在42℃中摇匀100s，再在冰浴中降温3min；所述培养得到培养液是于37℃，震荡培养24h。
[0019]在一个具体实施方式中，所述涂布培养具体是，涂布在抗生素固体培养基平板上稀释80
‑
120倍，涂布无抗生素的固体培养基平板稀释105‑
107倍，并于37℃培养20
‑
28h。
[0020]其中，根据阈值评估堆肥产品抗性基因环境健康风险，其中阈值在0.1以下为无风险，阈值在0.1～1.0之间为低风险，阈值在1.0以上为高风险。
[0021]关于风险阈值标准，是按下述方式确定：抗性基因水平转移具有扩散传染的特性，因此将1.0作为高风险阈值。堆肥中抗性基因会随着施肥过程进入土壤环境，若风险阈值大于1.0则随着堆肥中宿主微生物向土壤微生物传播，随着微生物生长繁殖，水平转移出去的抗性基因数量会逐渐增多，因此具有高风险；如果风险阈值在0.1～1.0间，随着微生物生长抗性基因会越传越少，几代后抗性基因丰度会极大削减，因此为低风险；如果风险阈值在0.10以下，则一到两代内抗性基因丰度就会极大削减，因此确定为无风险。例如，当风险阈值检测结果为1.1，假设堆肥样品中有一百万个耐药菌携带抗性基因，则在这些耐药菌扩散第一代后则会出现一百一十万个耐药菌(1000000
×
1.1＝1100000)，以此类推随着抗性基因扩散，会产生越来越多的耐药菌，因此风险高；再例如，如果风险阈值为0.01，则一百万个耐药菌进过第一代扩散后就仅剩余一万个，随着几代的扩散，抗性基因最终会逐渐减少，因此风险低。
[0022]本专利技术从抗性基因水平转移的全新角度来评估堆肥产品中抗性基因的环境健康风险，相较于传统的直接检测抗性基因丰度，本专利技术的评估方法更精准，为堆肥产品风险评估提供了有力支撑。这是因为抗性基因最主要的健康风险就是产生超级细菌，而超级细菌的出现除了自己突变出耐药基因就是从环境中通过水平转移获取其它抗性基因，而传统的丰度检测仅能代表一种堆肥中静态的抗性基因含量，不能去预测将来抗性基因会如何变化，而水平转移测试则是一种动态的能够预测将来抗性基因的变化趋势，因此用于评估健康风险更精准
附图说明
[0023]图1各实施例的风险阈值检测结果及等级。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。
[0025]在本专利技术的一些实施例中，提取堆肥产品中溶解性有机质时，首先本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种堆肥产品中抗性基因环境健康风险的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：取堆肥产品鲜样，提取堆肥有机质；将上述堆肥有机质与携带抗性基因质粒混匀培育得到混合液；向混合液中加入感受态大肠杆菌混匀后，培养得到培养液；分别制备无抗生素的固体培养基和相应抗生素的固体培养基，并将培养液分别在所述的两种类型固体培养基平板上涂布培养；分别对培养后的两种类型的固体培养基平板上的菌落进行计数，得到菌落个数；并按下述公式计算抗性基因水平转移频率P
堆肥产品
：其中N
AMP
表示相应抗生素的固体培养基上菌落个数；其中N
LB
表示无抗生素的固体培养基上菌落个数；对土壤样品同样按上述方法进行处理，得到两种类型的固体培养基平板上的菌落个数，并按同样的公式计算土壤样品抗性基因转移频率P
土壤样品
；根据下述公式计算抗性基因水平转移风险阈值，评估堆肥产品抗性基因环境健康风险：2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：所述堆肥产品或土壤样品有机质的提取方法如下：按照质量比堆肥产品或土壤样品1g：5
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15ml超纯水，进行震荡20
‑
28h，离心4000
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6000rpm，取上清液过滤膜提取。3.根据权利要求2所述的评估方法，其特征在于：其中震荡的时间为24h，离心为5000rpm，取上清液过0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄彩红，唐朱睿，李伟，席北斗，郭威，朱琳，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：