含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法技术

本申请涉及一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法。含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系构建方法包括：取含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；之后分化成早期原始造血细胞；再分化成类小胶质细胞系。含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas9系统构建，步骤包括：将含有Cas9 mRNA、sgRNA和TREM2突变基因的单链寡核苷酸显微注射至小鼠受精卵中，再移植到鼠输卵管内进行孕育，出生的小鼠即为含有TREM2突变基因的小鼠模型。本申请提供的类小胶质细胞系便于体外研究TREM2通过类小胶质细胞在AD病理过程中产生作用的原因，小鼠模型的建立便于体内研究TREM2突变对AD病理过程的作用机制。TREM2突变对AD病理过程的作用机制。TREM2突变对AD病理过程的作用机制。

【技术实现步骤摘要】
含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法


[0001]本申请属于基因工程
，具体涉及一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法。

技术介绍

[0002]阿尔兹海默病(Alzheimer
’
s disease，AD)是目前影响人类健康的主要神经退行性疾病，其典型表现为认知功能的缓慢进行性丧失。因其发病与年龄密切相关，且多发于老人；故随着社会人口的老龄化，发病率会越来越高。美国每800万人口就有2047位AD患者，中国的AD患病人群也有600
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1000万人。然而，到目前为止人类还没有治疗该病的有效措施。
[0003]研究发现，APP，PSEN1，PSEN2的基因变异和APOE的基因分型与AD的发生有很大关系。近年来通过GWAS研究发现髓系细胞2中表达触发受体(TREM2)基因发生变异后，AD的风险也会增高。TREM基因簇位于6号染色体p21.1，包含4个TREM基因(TREM1，TREM2，TREM4，TREM5)和两个TREM样的基因(TREML1，TREML2)。TREM2是髓系细胞细胞膜上的免疫球蛋白家族跨膜蛋白，在中枢神经系统中只表达在小胶质细胞上。小胶质细胞是脑内的巨噬细胞，在非特异免疫中发挥着关键作用，比如修剪突触，清除凋亡神经元等。在神经退行性疾病中，如在应对疾病特异性物质Aβ刺激时，稳态小胶质细胞通过两步激活为疾病相关小胶质细胞(DAM)，其中第二步依赖TREM2的正常功能。这近一步揭示小胶质细胞可能在AD的发生发展过程中起到重要作用，但仍难以深入探究TREM2在AD中发挥的作用。

技术实现思路

[0004]本申请的目的是提供一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法，以便于深入研究TREM2在AD病理过程中产生的作用。
[0005]为实现上述目的，本申请采用如下技术方案：
[0006]本申请第一方面提供了一种TREM2突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0007]本申请第二方面提供了一种重组载体，其包含本申请第一方面所述的TREM2突变基因。本申请对于构建重组载体时采用的载体的种类不做特别的限制，只要能够实现本申请的目的。
[0008]本申请第三方面提供了一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法，包括步骤：S1、取含有本申请第一方面所述的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；S2、将所述多能干细胞分化成早期原始造血细胞；S3、将所述早期原始造血细胞分化成类小胶质细胞系。
[0009]在本申请的一些实施方式中，步骤S1中，所述转录因子选自Oct4、Klf4、Sox2和c
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Myc中的至少一种；步骤S2中，所述分化是在含造血分化因子的培养基中进行分化；步骤S3中，所述分化是在含有CSF
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1、IL
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34和TGFβ1的无血清分化培养基中进行分化。
[0010]本申请第四方面提供了一种本申请第三方面所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系。
[0011]本申请第五方面提供了一种含有TREM2突变基因的小鼠模型的构建方法，所述含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas9系统进行构建，包括：将含有Cas9 mRNA、sgRNA和本申请第一方面所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸显微注射至小鼠的受精卵中，之后移植到假孕鼠输卵管内进行孕育，出生的小鼠即为所述含有TREM2突变基因的小鼠模型。
[0012]在本申请的一些实施方式中，所述TREM2突变基因的单链寡核苷酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
[0013]在本申请的一些实施方式中，所述Cas9 mRNA、所述sgRNA和本申请第一方面所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸的质量比为1：(0.4
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0.6)：(0.4
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0.6)；制备所述sgRNA时，采用的单链序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0014]本申请第六方面提供了本申请第五方面所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的小鼠模型。
[0015]本申请第七方面提供了本申请第一方面所述的TREM2突变基因、本申请第二方面所述的重组载体、本申请第四方面所述的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系或本申请第六方面所述的含有TREM2突变基因的小鼠模型在研究TREM2在阿尔茨海默病中的作用机制中的应用。
[0016]本申请提供的技术方案，具有如下的有益效果：
[0017]本申请采用的含有TREM2突变基因的皮肤组织细胞，可以诱导出多能干细胞，近一步分化为类小胶质细胞，从而获得携带TREM2突变基因的MUT细胞系；该类小胶质细胞细胞系的建立将更好的模拟人体内的病理过程，便于体外研究TREM2通过类小胶质细胞在AD病理过程中产生作用的原因。
[0018]本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本申请实施例1中的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法的流程示意图；
[0021]图2为本申请实施例1中iPSC分化为iHPCs的方法的流程示意图。
具体实施方式
[0022]下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本申请的保护范围。
[0023]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值
±
标准差。
[0024]目前针对TREM2在AD病理过程中发挥作用的模型主要应用的是通过人为敲除TREM2基因的小鼠模型，或者通过CRISPR/Cas9或BAC方法构建携带TREM2基因R47H突变的小鼠模型，探究的模型较为单一，不能很好的模拟病人的发病机制。
[0025]本申请始于本团队接诊的一位早发AD病人，进行全基因组测序后，发现患者存在一种首次发现的TREM2基因起始密码子突变。由此，专利技术人通过获取患者与正常对照组1
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4mm正常皮肤组织，诱导出多能干细胞，近一步分化为类小胶质细胞，获得了携带病人TREM2基因突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TREM2突变基因，其特征在于：所述TREM2突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1 所示。2.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求1所述的TREM2突变基因。3.一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法，其特征在于，包括步骤：S1、取含有权利要求1所述的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；S2、将所述多能干细胞分化成早期原始造血细胞；S3、将所述早期原始造血细胞分化成类小胶质细胞系。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述转录因子选自Oct4、Klf4、Sox2和c
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Myc中的至少一种；步骤S2中，所述分化是在含造血分化因子的培养基中进行分化；步骤S3中，所述分化是在含有CSF
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1、IL
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34和TGFβ1的无血清分化培养基中进行分化。5.权利要求3或4所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系。6.一种含有TREM2突变基因的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐毅，秦琪，韦玉生，李沉简，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：