一种马兜铃酸特异结合多肽及应用制造技术

本发明专利技术涉及针对马兜铃酸I(aristolochic acid，AA)特异性结合多肽及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术以马兜铃酸I为靶标，运用噬菌体展示技术平台，通过多轮富集淘选获得马兜铃酸I特异性结合多肽，并利用原核表达系统对获得的多肽进行了大量制备，通过荧光淬灭实验证明了多肽与马兜铃酸I特异结合。所述多肽相比于单克隆抗体具有制备成本低、易合成等优点，可用于检测含有马兜铃酸的中药材、天然植物、食品以及其他产品的检测应用。品以及其他产品的检测应用。品以及其他产品的检测应用。

【技术实现步骤摘要】
一种马兜铃酸特异结合多肽及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及马兜铃酸的特异结合多肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]马兜铃酸(Aristolochic acids，简称AAs)是一类硝基菲有机酸类化合物，包括马兜铃酸I、II、III、IV及其衍生物等，是广泛存在于马兜铃科马兜铃属Aristolochia植物的一类化学成分。自然界中约有200余种植物含有马兜铃酸成分，其中用于治疗的马兜铃科植物约80余种，国内主要应用于抗感染、抗肿瘤、增强免疫力等，国外主要用于中药减肥、湿疹、水肿、乙型病毒性肝炎或中药保健品等。然而，大量临床和实验表明，服用含有马兜铃酸的中成药可导致不可逆性地急性、慢性肾小管间质化及泌尿系统肿瘤等肾损害。此外，马兜铃酸还具有致基因突变性，长期服用会导致肾癌、淋巴癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤发生。2012年世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构将其列为I类致癌物。为确保临床用药的安全有效，预警患者体内可能发生的毒副反应，实现马兜铃酸快速高效检测具有十分重要的科学与社会意义。
[0003]马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸I或其代谢物马兜铃内酰胺所致。因此，在检测马兜铃酸时，常选择马兜铃酸I为指标性成分。目前，检测马兜铃酸I的方法主要有基于色谱分析的理化分析法(如薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等)和基于抗体、抗原特异性结合反应的免疫分析法(如酶联免疫分析法、免疫层析法、免疫传感器等)。其中薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低；高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱
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串联质谱法(HPLC
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LC/MS)灵敏度较高、测定准确，是目前测定马兜铃酸I最常用的方法，但仪器设备昂贵，对实验人员专业技能要求高。对于免疫分析法，马兜铃酸类化合物，免疫原性低且毒性大，其高特异性抗体制备较为困难，且灵敏度低、稳定性差、实用性不强。因此。因此，开发马兜铃科植物相关药品、食品中马兜铃酸I的快速、灵敏的分析检测方法，对于了解马兜铃酸I所引起的污染具有重要意义。
[0004]亲合体(affibody)是一种衍生于葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结构域B段的结构蛋白，是一类新型的亲和配体。其为单链结构，由58个氨基酸残基组成，结构中含有3个α
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螺旋。亲合体的受体结合部位包含13个氨基酸残基，Karin Nord将这13个氨基酸的密码子分别用简并密码子进行替换，所形成的这些突变体就构成了亲合体分子库，由此重组产生的不同的亲合体可分别对许多靶蛋白分子具有特异性结合活性和高度亲和力，这些靶蛋白包括胰岛素、纤维蛋白、转铁蛋白(TRF)、肿瘤坏死因子α(TNF
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α)等。亲合体多肽功能上类似于抗体，同时具有抗体分子所没有的优点，包括相对分子量小，稳定性高，亲和力和特异性好，应用灵活、易制备等，在生物科学的许多领域中得到广泛应用。本专利技术使用噬菌体展示技术筛选到马兜铃酸I特异性结合多肽，该多肽将应用于马兜铃酸I定量或定性检测等。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于噬菌体展示技术平台，利用全合成亲合体多肽分子库，通过多轮富集
淘选出马兜铃酸I特异性结合多肽。利用BL21(DE3)宿主细胞表达系统制备马兜铃酸I特异性结合多肽，通过荧光淬灭实验验证淘选到的特异结合多肽与马兜铃酸I的结合能力及结合特异性。结果表明，所获得的亲合体多肽可与马兜铃酸I特异性结合，为后续检测中药材、天然植物、食品中的马兜铃酸奠定基础。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]针对马兜铃酸I特异性结合的多肽序列为由葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白结合区域通过突变1
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13个氨基酸残基获得，具有马兜铃酸I高结合活性。
[0008]所述的马兜铃酸I特异性结合多肽序列，其特征在于，所述特异性结合马兜铃酸I的多肽可连接荧光发光基团、生物素、放射相关基团、纳米材料等。
[0009]所述的马兜铃酸I特异性结合多肽在检测含有马兜铃酸的中药材、天然植物、食品以及其他产品方面的应用。
[0010]本专利技术的优点和积极效果：
[0011]本专利技术基于噬菌体展示技术，通过八轮富集从全合成亲合体多肽分子库淘选出了马兜铃酸I特异性结合多肽，该多肽特异亲和力好，且相比于单克隆抗体具有制备成本低、操作难度小等显著优点。
附图说明
[0012]图1噬菌体展示筛选特异性结合马兜铃酸I的多肽过程中每一轮富集倍数。
[0013]图2七轮多克隆噬菌体ELISA结果，BSA为阴性对照
[0014]图3筛选到的阳性噬菌体克隆噬菌体ELISA结果，BSA为阴性对照
[0015]图4为筛选到的特异性结合马兜铃酸I的多肽氨基酸序列以及比对结果。
[0016]图5为25℃以及35℃下，马兜铃酸I与其亲和体的荧光淬灭实验结果。
[0017]图6为马兜铃酸I与其亲合体的解离常数、淬灭常数以及淬灭率常数
[0018]图7为马兜铃酸I与其亲合体分子对接分析。
具体实施方式
[0019]以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0020]实施例1马兜铃酸I特异性结合多肽的淘选鉴定与表达纯化
[0021]1、马兜铃酸I特异结合多肽的多轮富集
[0022]针对葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合区域多肽第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32和35位氨基酸残基设计以NNK为密码子的简并引物，利用简并引物通过over
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lap PCR得到亲合体多肽文库的编码基因。将多肽突变体编码基因克隆至噬菌体展示载体，重组质粒电转化至TG1宿主细胞获得库容为5
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107的亲合体多肽突变体文库。利用辅助噬菌体将亲合体多肽突变体进行展示，进而得到多肽突变体噬菌体展示文库。
[0023]为提高富集效率，逐轮降低马兜铃酸I
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载体蛋白使用量，并通过BSA
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AAI以及OVA
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AAI交替淘选、减少噬菌体与AAI
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载体蛋白的结合时间、增加洗涤次数等操作将富集条件严格化，通过多轮富集获得马兜铃酸I特异结合affibody展示噬菌体。
[0024]分别以马BSA
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AAI以及OVA
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AAI为靶标，加入亲合体噬菌体展示文库，经过八轮富集淘选，在第七轮捕获的噬菌体较第一轮富集了8倍，各轮富集的噬菌体的富集倍数见附图1。
[0025]进一步通过噬菌体ELISA检测多肽与马兜铃酸I的结合能力。经过八轮淘选后，对各轮富集的结果进行噬菌体ELISA检测，检测多肽与马兜铃酸I的结合能力，结果见本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本专利涉及一种特异性结合马兜铃酸I的多肽，其特征在于，所述特异性结合马兜铃酸I多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.如权利要求1所述多肽，其特征在于，所述多肽可以与马兜铃酸I特异性结...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵青，刁爱坡，李玉银，张亚新，蒋怡，包凤娇，陈林，陈曦，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：