一种快速检测CD19/CD20-CAR-T细胞活性的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，提供了一种免疫细胞及其活性测定的方法。本发明专利技术提供了一种检测CD19/CD20

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测CD19/CD20
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CAR
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T细胞活性的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种免疫细胞及其活性测定的方法。具体而言，本专利技术提供了一种快速检测识别CD19和CD20的 CAR
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T（CD19/CD20
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CAR
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T细胞）细胞活性的方法及其用途。

技术介绍

[0002]免疫疗法旨在增强患者自身的免疫系统以对抗疾病，可以分为主动免疫和被动免疫两大类。近年来，各种旨在诱导、加强或改造 T 细胞反应的免疫治疗策略已成为治疗癌症和自身免疫性疾病的有前途的方法。免疫疗法在肿瘤的发生发展过程中有很重要的作用，不仅可以预防癌症的发生，还可以通过增强机体的免疫力而缓解甚至治疗癌症。
[0003]过继性细胞治疗是细胞免疫治疗一个主要的研究方向。过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor
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infiltrating lymphocytes，TIL)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。目前使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine
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induced killer，CIK）、树突细胞
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细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells
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cytokine induced killer，DC
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CIK）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti
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CD3 antibody
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induced activated killer cells, CD3
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AK cells）等。然而CIK等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。
[0004]在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor, TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞（TCR
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T）或CAR
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T细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。在CAR
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T细胞治疗制备过程中，制备完成的CAR
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T细胞的激活活性的鉴定和质控是至关重要的一个环节。CAR
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T细胞治疗综合运用了识别和靶向疾病的抗体技术，它是一种活体药物，不仅不会像传统药物被代谢掉，还会在病人体内复制，或者形成记忆细胞，一次给药可以延续很长时间。与单抗治疗相比，CAR
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T细胞治疗具有许多优势，如强大的体外扩增能力、体内存续时间久、针对低表达量的靶分子仍然有效等。CAR
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T细胞治疗目前已成功运用于多种肿瘤疾病的临床试验中，包括多数血液肿瘤以及肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、神经肿瘤等实体瘤。
[0005]传统的抗肿瘤方法效果检测包括血液指标、瘤体大小、细胞成分分析等等，但是这些方法往往耗时较长，或者属于定性检测结果而指导作用不明确。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是开发一种基于生物发光报告基因的生物方法，可以在CD19和CD20 CAR
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T 制备完成后，快速准确的评估CAR
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T细胞活化和活性。
[0007]本专利技术提供了一种检测CD19/CD20
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CAR
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T细胞活性的工程细胞。所述的细胞是含有NFAT
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RE
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luciferase载体的肿瘤细胞株，所述的含有NFAT
‑
RE
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luciferase载体的肿瘤细
胞株中含有CD19抗体和/或CD20抗体的编码序列，NFAT
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RE
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luciferase中NFAT
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RE与luciferase 串联。
[0008]肿瘤细胞可以选用各种已经永生化或者商品化的细胞，通常是ATCC或者中国科学院生命科学分院细胞库中可以提供的细胞，也可以针对具体的肿瘤或者癌症类型进行细胞改造，例如，对于血液类癌症可以使用各种相应的悬浮癌细胞。但是，并非所有的肿瘤细胞都适于本专利技术，在本专利技术的一个优选例中，所述的肿瘤细胞是K562细胞。
[0009]NFAT(Nuclear Factor of Activated T cells)转录因子家族在免疫反应中对多种细胞因子的表达有重要作用，也参与了肿瘤免疫、心肌功能调控、凋亡等多种功能，包括钙调蛋白和蛋白激酶C在内的多种信号通路都可以通过NFAT发挥作用。NFAT
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RE
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Luci稳转细胞株的基因组中稳定整合NFAT控制表达的luciferase基因。NFAT激活启动luciferase表达，通过检测luciferase活性可以灵敏地反应NFAT通路的状态。
[0010]CD19是簇分化抗原的一种，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。CD19分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B细胞最好的标记。
[0011]CD20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的B细胞)外的发育分化各阶段的B细胞的表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。
[0012]本专利技术中CD19和CD20的序列是从各种来源中筛选获得的，例如本专利技术的一个优选例中使用噬菌体筛选技术获得CD19和CD20的序列。
[0013]本专利技术的一个优选例中，CD19抗体的氨基酸序列为：LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEA（SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测CD19/CD20
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CAR
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T细胞活性的工程细胞，其特征在于，所述的工程细胞是含有NFAT
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RE
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luciferase载体的肿瘤细胞，所述的含有NFAT
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RE
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luciferase载体的肿瘤细胞中含有CD19抗体和/或CD20抗体的编码序列，NFAT
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RE
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luciferase中NFAT
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RE与luciferase 串联。2.根据权利要求1所述的检测CD19/CD20
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CAR
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T细胞活性的工程细胞，其特征在于，所述的肿瘤细胞是K562细胞。3.权利要求1或2所述细胞的制备方法，其特征在于，将CD19抗体和/或CD20抗体的编码序列与luciferase荧光素酶的基因共同重组表达在慢病毒质粒中或者将CD19抗体和/或CD20抗体的编码序列插入NFAT
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RE
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luciferase载体；包括以下步骤：（1）在K562悬浮细胞中加入转染试剂，充分混匀，孵育；（2）2
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6小时后，加入培养基以稀释转染试剂或者更换基础培养基；（3）继续培养3
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4天，视细胞生长情况传代或换液；（4）获得稳定转染NFAT
‑
RE
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luciferase 的K562细胞株。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的CD19抗体的氨基酸序列为：LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEA；或者，所述的CD20抗体的氨基酸序列为：GGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNG...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，梁辉，沈琦，张文桦，田静，彭家伟，李雪玲，王丹，刘泽熙，陈晓敏，崔明青，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：