外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用技术

本发明专利技术公开一种外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用，涉及生物工程技术领域。所述外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术提供的外切型菊糖酶INUGold，是以马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶INU1的氨基酸序列(X57202.1)为原始材料，通过人工的设计改造，对外切型菊糖酶INU1进行了定点突变改造，得到了具有高活性的外切型菊糖酶INUGold(SEQ ID NO：2)，将其用来制备果糖时，显著提高了果糖的生产效率，可用于果糖的工业化生产。化生产。化生产。

【技术实现步骤摘要】
外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用。

技术介绍

[0002]果糖是一种优秀的单糖，它口感好、甜度高且升糖指数低，被称为“健康糖”。果糖是主要的食用糖。尤其随着消费观念的改变，食品和饮料行业对果糖的需求量越来越大，果糖和果葡糖浆的用量已经成为食用糖的主要产品。
[0003]目前，工业生产果糖的方法主要有两种：一、通过淀粉酶水解成葡萄糖，随后，葡萄糖在葡萄糖异构酶的作用下转化成果糖，此即为双酶法工艺，但通常只能得到果糖和葡萄糖的混合物(即常说的果葡糖浆)，如果需要纯的或者高含量的果糖，则需要进行复杂的纯化工艺；二、通过酸法和酶法将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，然后通过离子排斥层析从葡萄糖中分离果糖，而酸法水解蔗糖存在潜在的污染，且通过异构酶转化葡萄糖制备的果葡糖浆混合物通常果糖含量仅有42％。如果需要高纯度的果糖，则需要后继的复杂的分离纯化系统。
[0004]菊糖(又称菊粉)是一种仅次于淀粉的可食用性、储藏性多糖，它广泛存在于菊科植物中，是一种来源丰富、价格低廉的可再生资源。其主要存在于菊芋和菊苣中，故名菊糖。菊糖是一种由果糖单体聚合形成的天然大分子聚合物，它于1804年由德国科学家首次从植物中提取。菊糖是由β
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D
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果糖苷键连接多个果糖基而成的链状多糖。天然菊糖是由长度不同、聚合度各异的果糖聚合物组成的一种混合物，其聚合度(DP)大致在2～100之间。因此，菊糖是生产果糖的理想材料。而通过外切型菊糖酶水解菊糖以产生果糖是一种有效的、绿色的和先进的技术。
[0005]外切型菊糖酶在植物和微生物中均有分布，但从自然中获得的微生物生产出的外切型菊糖酶的活性较低，从而限制了外切型菊糖酶的工业化应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的是提出一种外切型菊糖酶INUGold及其制备方法、以及其应用，旨在提供一种高活性的外切型菊糖酶。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提出一种外切型菊糖酶INUGold，所述外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]此外，本专利技术还提出一种外切型菊糖酶基因，所述外切型菊糖酶基因用于编码如上所述的外切型菊糖酶INUGold。
[0009]可选地，所述外切型菊糖酶基因的核苷酸序列如ID NO：1所示。
[0010]此外，本专利技术还提出一种表达盒，所述表达盒包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
[0011]此外，本专利技术还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
[0012]此外，本专利技术还提出一种重组菌株，所述重组菌株包括如上所述的外切型菊糖酶基因。
[0013]可选地，所述重组菌株的宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉菌和酵母菌中的任意一种。
[0014]可选地，所述酵母菌包括乳酸克鲁维酵母。
[0015]此外，本专利技术还提出一种外切型菊糖酶INUGold的制备方法，培养如上所述的重组菌株，得到外切型菊糖酶。
[0016]此外，本专利技术还提出一种如上所述的外切型菊糖酶INUGold在制备果糖中的应用。
[0017]本专利技术提供的外切型菊糖酶INUGold，是以马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶INU1的氨基酸序列(X57202.1)为原始材料，通过人工的设计改造，对外切型菊糖酶INU1进行了定点突变改造，得到了具有高活性的外切型菊糖酶INUGold，所述外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，将其用来制备果糖时，显著提高了果糖的生产效率，可用于果糖的工业化生产。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0019]图1为本专利技术实施例1中出发材料外切型菊糖酶INU1的三维结构；
[0020]图2为本专利技术实施例1中外切型菊糖酶INUGold活性中心的三维结构；
[0021]图3为本专利技术实施例3中的重组表达载体pGKLAC
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inugold的图谱；
[0022]图4为本专利技术实施例3中的重组表达载体pGKLAC
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inugold经双酶切后的凝胶电泳图；
[0023]图5为本专利技术实施例5中的各发酵上清液的SDS
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PEGE结果；
[0024]图6为本专利技术实施例5中的各发酵上清液的酶活测试结果。
[0025]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0026]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0027]另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本专利技术要求的保护范围之内。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]本专利技术提出一种外切型菊糖酶INUGold，所述外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0029]在本实施例中，以马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)外切型菊糖酶INU1的氨基酸序列(X57202.1)为出发材料，人工设计改造优化，获得了新型外切型菊糖酶INUGold，从而提高了原始菊糖酶的活性，将具有高活性的外切型菊糖酶INUGold用来制备果糖时，显著提高了果糖的生产效率，可用于果糖的工业化生产。
[0030]具体地，本专利技术基于侯选菊糖酶INU1的蛋白序列，在对序列特点统计分析基础上，探究蛋白质的序列
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结构
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功能之间的关系，基于蛋白质结构的信息以及大规模数据统计和深度学习，设计并获得序列底物/产物催化效率提高的新型外切型菊糖酶INUGold。新型外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。与原始菊糖酶INU1序列差异主要在于第65位天冬氨酸突变为亮氨酸(D65L)、第241位的甘氨酸突变为天冬氨酸(G241D)、第306位的甲硫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外切型菊糖酶INUGold，其特征在于，所述外切型菊糖酶INUGold的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种外切型菊糖酶基因，其特征在于，用于编码如权利要求1所述的外切型菊糖酶INUGold。3.如权利要求2所述的外切型菊糖酶基因，其特征在于，所述外切型菊糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.一种表达盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的外切型菊糖酶基因。5.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的外切型菊糖酶基因。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘燕玲，杨巍，邹茂翠，
申请(专利权)人：武汉金科天成科技有限公司，
类型：发明
国别省市：