一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法技术

本发明专利技术建立一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法，属于生物检测技术领域。设计优选Cas13a反式剪切中介物发夹结构及产物对应引导CrRNA。靶RNA识别并结合Cas13a/RNA1复合物，激活Cas13a高效反式剪切中介物发夹结构生成含脚趾的产物双链RNA2为次级靶；次级靶RNA2识别并激活Cas13a/RNA2复合物，循环剪切中介物发夹结构并累积激活Cas13a，累积活性Cas13a最终剪切报告RNA，由此实现双级联循环激活Cas13a无扩增快速检测RNA。该方法快速、简单、特异性及灵敏度良好，且所设计中介物及对应引导CrRNA组合，对不同疾病相关RNA及病毒RNA通用。所建立方法和试剂盒可用于生物样本中疾病相关微量RNA及微量病毒RNA的快速检测。微量病毒RNA的快速检测。微量病毒RNA的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法


[0001]本专利技术属于RNA无扩增快速检测
，涉及RNA靶识别并激活Cas13a后中介物介导的双级联循环激活Cas13a快速放大信号用于RNA定量检测的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]与疾病相关的RNA包括mRNA、micRNA、rRNA、tRNA，都参与了基因表达、基因调控和代谢调控等，可作为疾病诊断的早期标志物[Cell Metabolism,2018,27,714
‑
739]。RNA病毒是以RNA为遗传物质的病毒，如SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、一小部分噬菌体、新型冠状病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、全部流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、烟草花叶病毒等[Reviews in Medical Virology,2021,31]。RNA稳定性差，易发生变异。疾病相关的RNA和RNA病毒的快速检测和早筛早诊具有重要意义。
[0003]现有临床检测RNA方法是RT
‑
PCR，其需要反复变性退火等过程，操作繁琐、耗时长。一系列基于等温扩增RNA检测方法被开发，如RCA，EXPAR，NASBA；但基于扩增的信号放大策略体系复杂，耗时较长。新兴CRISPR
‑
Cas基因剪切系统[Science,2007,315,1709
‑
1712,Crispr Journal,2018,1,325/>‑
336,NatureReviews Microbiology,2020,18,67
‑
83]，通过Cas酶引导RNA(CrRNA)定点识别靶序列并结合而被激活，可高效地非特异性剪切报告核酸单链，利用Cas13a/12a的特异性识别和非特异性剪切，有望实现核酸检测的高灵敏度，高特异性检测。2018年，张锋、Jennifer相继在Science发文[Science,2018,360,444
‑
448,Science, 2021,371,791
‑
791]，将Crispr
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Cas13a、Crispr
‑
Cas12a联合等温扩增建立了RNA病毒检测方法即“SHERLOCK”、“DETECTR”。经逆转录及LAMP联合Crispr检测SARS
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CoV
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2[Nature BiomedicalEngineering,2020,4,1150
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1158]。但这些方法均需要联合逆转录和等温扩增过程，体系仍然较为复杂且耗时长；有研究者应用CRISPR
‑
Cas建立微流控体系直接检测micro RNA，但灵敏度有限[Acs Sensors,2019,4, 1048
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1054]。仍需开发快速、简便、灵敏、特异检测RNA新方法。
[0004]Cas13a可特异性识别RNA并被激活后高效剪切报告核酸单链，为RNA的检测提供较理想工具酶，但现有基于Cas13a的RNA检测仍需前端扩增靶RNA以提高灵敏度。为进一步降低时间消耗、降低设备门槛、简化操作步骤，本专利技术旨在建立RNA靶识别并激活Cas13a后中介物介导再循环激活Cas13a快速放大信号的定量检测技术，开发微量靶标RNA无扩增快速检测新方法。

技术实现思路

[0005]1.一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法，其特征过程和原理如下：
[0006]当Cas13a与Cas酶引导RNA(CrRNA)形成复合物Cas13a/CrRNA后，靶RNA识别并结合
CrRNA可变区，产生双螺旋RNA的刚性结构，使半拳状Cas13a酶构象改变为紧握拳状结构而被激活，具有特异性顺式剪切靶RNA和高效非特异反式剪切RNA活性；靶RNA激活Cas13a/CrRNA的结合摩尔比为1:1，基于靶定量激活非特异反式剪切的碱基偏好性，设计荧光报告探针，检测荧光改变而定量靶RNA；当靶RNA 浓度过低时，只能产生微量活化Cas13a，导致难以检出探针信号，或需要延长剪切时间，此时须结合信号放大技术；LbuCas13a酶反式剪切碱基偏好U>G>A＝C，一定时间内只剪切U碱基；Cas13a/CrRNA复合物既能结合单链靶RNA而被激活，经实验发现Cas13a/CrRNA复合物也可以从双链RNA的脚趾端启动分支链迁移的链置换反应而被激活。
[0007]基于以上特性，本专利技术设计了中介物发夹结构，构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法；所述方法原理如下：
[0008]靶RNA1识别并结合Cas13a与引导CrRNA1的复合物(Cas13a/CrRNA1)，激活Cas13a并高效反式剪切中介物发夹结构(HP)生成带脚趾的双链RNA2为次级靶；次级靶RNA2识别并激活Cas13a与次级靶引导RNA2的复合物(Cas13a/CrRNA2)，循环剪切中介物发夹结构再激活Cas13a，短时间内激活大量Cas13a 酶，最终实现报告RNA的高效剪切；由此构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法。
[0009]2.如权利要求1所述方法，其中中介物发夹结构，包括但不限于如下单元结构序列和特征：
[0010]5’‑
GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAAC
‑3’
[0011]5’‑
GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUUUAACACACACAAAAC
‑3’
[0012]5’‑
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‑3’
[0013]5’‑
CGUGGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCCACG
‑3’
[0014][0015]所述中介物发夹结构特征在于1)发夹结构为纯RNA链，2)环端靠3
’
端包含至少2个U碱基，优选 2
‑
4个U碱基，环端另有4
‑
8个非U碱基，3)发夹结构的茎端包含至少14
‑
20个互补碱基对，优选14
‑
个互补碱基对，4)环端和茎端可识别权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区，5)茎末端另设计含3
‑
6 对互补配对为阻碍碱基，与权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区不能互补配对。
[0016]3.如权利要求1
‑
2所述方法，其中中介物发夹结构包括但不限于单个发夹结构或多个发夹结构单元的耦合核酸结构。
[0017]4.如权利要求1
‑
3所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法，其特征过程和原理如下：当Cas13a与Cas酶引导RNA(CrRNA)形成复合物Cas13a/CrRNA后，靶RNA识别并结合CrRNA可变区，产生双螺旋RNA的刚性结构，使半拳状Cas13a酶构象改变为紧握拳状结构而被激活，具有特异性顺式剪切靶RNA和高效非特异反式剪切RNA活性；靶RNA激活Cas13a/CrRNA的结合摩尔比为1:1，基于靶定量激活非特异反式剪切的碱基偏好性，设计荧光报告探针，检测荧光改变而定量靶RNA；当靶RNA浓度过低时，只能产生微量活化Cas13a，导致难以检出探针信号，或需要延长剪切时间，此时须结合信号放大技术；LbuCas13a酶反式剪切碱基偏好U>G>A＝C，一定时间内只剪切U碱基；Cas13a/CrRNA复合物既能结合单链靶RNA而被激活，经实验发现Cas13a/CrRNA复合物也可以从双链RNA的脚趾端启动分支链迁移的链置换反应而被激活。基于以上特性，本发明设计了中介物发夹结构，构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法；所述方法原理如下：靶RNA1识别并结合Cas13a与引导CrRNA1的复合物(Cas13a/CrRNA1)，激活Cas13a并高效反式剪切中介物发夹结构(HP)生成带脚趾的双链RNA2为次级靶；次级靶RNA2识别并激活Cas13a与次级靶引导RNA2的复合物(Cas13a/CrRNA2)，循环剪切中介物发夹结构再激活Cas13a，短时间内激活大量Cas13a酶，最终实现报告RNA的高效剪切；由此构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法。2.权利要求1所述方法，其中中介物发夹结构，包括但不限于如下单元结构序列和特征：5
’‑
GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAAC
‑3’5’‑
GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUUUAACACACACAAAAC
‑3’5’‑
GGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCC
‑3’5’‑
CGUGGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCCACG
‑3’
中介物发夹结构特征在于1)发夹结构为纯RNA链，2)环端靠3
’
端包含至少2个U碱基，优选2
‑
4个U碱基，环端另有4
‑
8个非U碱基，3)发夹结构的茎端包含至少14
‑
20个互补碱基对，优选14
‑
个互补碱基对，4)环端和茎端可识别权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区，5)茎末端另设计含3
‑
6对互补配对为阻碍碱基，与权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区不能互补配对。3.如权利要求1
‑
2所述方法，其中中介物发夹结构包括但不限于单个发夹结构或多个发夹结构单元的耦合核酸结构。4.如权利要求1
‑
3所述方法，其中中介物被反式剪切生成的双链含脚趾次级靶，其特异性识别并结合的引导CrRNA2包括但不限于如下结构序列和特征：5
’‑
GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUCGGCAAACACACACAAAAC
‑3’
所述CrRNA2包括不变区与可变区两部分，其中不变区结合Cas13a蛋白酶，所述可变区与权利要求2所述中介物的3
’
端20
‑
26个碱基互补配对。5.如权利要求1
‑
4所述方法，其中中介物介导的双级联循环激活反应特征过程在于：1)靶RNA1识别并激活的Cas13a反式剪切活性，优先剪切如权利要求2和3所述中介物发夹结构的两个U碱基位点，生成含粘性末端的RNA2双链结构，作为次级靶；2)次级靶结合Cas13a/CrRNA2复合物，发生分支链迁移的链置换反应，并激活Cas13a反式剪切，重复过程1)循环剪切中介物并累积激活大量Cas13a。6.如权利要求1
‑
4所述方法，其中中介物及其剪切后次级靶的引导CrRNA2的结构组合，通用于不同靶RNA，通用于不同靶DNA，仅预先按常规方法将靶DNA转录为RNA即可。7.如权利要求1所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法，其特征步骤如下：1)将Cas13a与CrRNA1混和，混合比Cas13a:CrRNA为5:1～1:1，优选2:1，冰上或室温预孵育5～20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA1；2)将Cas13a与CrRNA2混匀，混合比Cas13a:CrRNA为5:1～1:1，优选2:1，冰上或室温预孵育5～20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA2；3)将待测样品、预孵育Cas13a/CrRNA1、预退火的中介物、预孵育Cas13a/CrRNA2、10
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反应缓冲液、焦碳酸二乙酯处理水，共40微升，混匀，20～37摄氏度孵育10～60分钟，优选37摄氏度孵育15分钟；4)将10微升报告探针加入如上3)所得反应混合物中，总体积为50微升，使中介物终浓度为50皮摩尔/升～50纳摩尔/升，优选100～200皮摩尔/升，Cas13a/CrRNA1、Cas13a/CrRNA2终浓度均为10皮摩尔/升～50纳摩尔/升，优选1～10纳摩尔/升，再优选10纳摩尔/升，报告探针终浓度为100～1000纳摩尔/升，优选20～200纳摩尔/升，混匀后...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓兰，曾宏威，胡小蕾，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：