用于核酸的大小选择性富集的方法、组合物和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于从生物流体混合物中分离和浓缩选定靶大小(例如，以小于1000个碱基对的增量)的核酸的方法，该方法包括将该生物流体混合物与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一双水相系统(ATPS)合并，使得小于所希望的靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液中并且污染物分配到该第一相溶液中，提取第二相溶液并将其与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合，使得这些靶核酸片段分配到该第三相溶液并在其中浓缩，以及从该第三相溶液中回收这些浓缩的靶核酸片段。还提供了组合物和试剂盒，用于如上所述分离和浓缩选定靶大小的核酸。选定靶大小的核酸。选定靶大小的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸的大小选择性富集的方法、组合物和试剂盒


[0001]本专利技术涉及在连续水相系统中分离、浓缩和/或纯化核酸片段。特别地，本专利技术提供了用于从生物材料中分离、浓缩和/或纯化核酸片段的样品制备方法、组合物和试剂盒组分。

技术介绍

[0002]从复杂基质如血液、组织、尿液和法医样品以及细菌和哺乳动物细胞培养基中分离和纯化核酸(如DNA和RNA)的方法在遗传研究、核酸探针诊断、法医DNA测试和其他需要扩增、加工或分析核酸的领域中是重要的。纯化的核酸必须具有高质量并达到足够的量，使得它们可用于各种下游应用，这些下游应用包括检测、测序、临床诊断等。由于在鉴定核酸的复杂环境(包括尿液、血液、血浆、血清、唾液和其他生物流体)中存在大量污染性细胞物质(例如蛋白质和碳水化合物)，因此获得纯化的核酸是一项复杂的任务。目前从生物样品中提取和纯化核酸的方法通常是耗时的、繁琐的、昂贵的，涉及使用危险的有机溶剂，并且通常仅适于捕获某些大小(例如1000bp)以上的核酸。
[0003]对于在诸如尿液和血液的生物流体中以非常低的浓度存在的靶分析物，需要获得大体积的生物流体以便获得足够量的靶分析物用于随后通过分子技术进行检测。检测具有极低浓度的分析物的存在是一项重大挑战。分析物可以是疾病的生物标志物，如无细胞DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)或存在于样品如患者的唾液、血液、尿液和其他体液中的蛋白质。如果分析物浓度太低，许多现有的诊断或检测方法可能错误地报告分析物不存在。例如，如果靶分析物具有超出测定检测极限的极低量，如聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)的诊断黄金标准可能产生假阴性结果。
[0004]当生物标志物以少量存在时，精确的检测依赖于可以从背景中浓缩核酸的分离方法。根据分离方法，这种挑战可能会因核酸片段大小的变化和测试抑制剂的影响而变得复杂。多种方法已经用于纯化核酸。这些方法包括沉淀、超滤(Hirasaki等人,J.Membr.Sci.[膜科学杂志],106:123
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129(1995))以及使用阴离子交换柱的吸附。包括市售方法的其他测试方法具有较低的DNA提取产量并且不能提取长度小于200bp的小DNA片段(Fong等人,Clinical Chemistry[临床化学]55(3),587
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589,2009)。Ribeiro等人(Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程]2002年5月20日；78(4):376
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84)描述了具有PEG作为聚合物组分和磷酸氢二钾(K2HPO4)作为盐组分的双水相系统(ATPS)。报道了从大肠杆菌DH5a中分离出质粒pCF1
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CFTR。为此，首先通过碱裂解(含有NaOH和SDS的裂解缓冲液)分解细胞，然后用3M乙酸钠中和裂解物。随后通过离心批料除去细胞碎片、蛋白质和基因组DNA(gDNA)。将澄清的裂解物用于上述双水相系统中。然而，该方法的缺点是在设备和时间方面非常昂贵。上述文章的全部内容通过引用并入本文。商用台式固相试剂盒，例如由和提供的那些试剂盒，允许相对快速地提取和纯化核酸，但需要台式实验室设备，这意味着提取和纯化在很大程度上限于具有基本设置和电源的实验室。
[0005]因此，非常需要一种简化的方法和装置，以精确、更高信噪比用于下游应用，与各
种工业、临床和研究用途(例如即时测试)相容的廉价方式实现较高浓度和较多数量的小靶片段大小的核酸分子。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的上述限制，披露了新的方法、组合物和试剂盒，其用于在不需要复杂设备的情况下，在使用连续双水相系统(sequential aqueous two
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phase systems(ATPS))的廉价、快速和完全液体方法中对分析物进行大小选择性富集、分离和分析。这些方法和组合物可实现以下多项任务，包括细胞裂解、除去非靶向生物分子和/或浓缩靶向分析物。在一些实施例中，分析物是小于选定大小的核酸片段，例如包含少于1000个碱基对(例如少于10,000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、或50bp)的核酸。在一些实施例中，分析物是单链核酸，而在其他实施例中，分析物是双链核酸。可以通过ATPS相形成和分级组分的适当选择和特定排序，以及离心、混合和孵育步骤来选择靶大小截止值。在一些实施例中，核酸片段可以在最有利于分析的范围内在小于1000bp的情况下以50bp靶大小截止精度，并且更优选以25bp精度，分离和浓缩。
[0007]本专利技术提供了一种改进的方法，用于从生物样品中纯化核酸，然后从核酸中除去ATPS组分，否则ATPS组分将干扰下游应用如疾病检测、扩增和基因分型。示例性生物样品可以包括血液、血浆、唾液、尿液、细胞、外来体、蛋白质、cfDNA、RNA和循环肿瘤细胞。专利技术人出乎意料地发现，所披露的稳定的、可重复的方法实现了核酸纯化而几乎没有核酸损失(即，非常高的回收率)，并且通过提取独特ATPS的一个相，将其与具有与第一ATPS的相形成组分不同的化学性质的相形成组分混合，可以形成第二ATPS，其中靶核酸将分配到第二ATPS中与它们在第一ATPS中分配的相相反的相中。
[0008]在一些实施例中提供了一种披露的方法，用于从包含核酸和污染物的流体生物混合物中分离和浓缩所希望靶大小的核酸。生物混合物可以与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一ATPS合并，使得通过分配到所述第二相溶液来分离小于靶大小的靶核酸片段而污染物分配到第一相溶液。然后可以提取第二相溶液并与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合，使得通过分配到第三相溶液中来浓缩靶核酸片段。然后浓缩的靶核酸片段可以以多种方式从第三相溶液中回收。
[0009]在一些实施例中，第一和第二相形成聚合物或表面活性剂组分可包含一种或多种聚合物、一种或多种表面活性剂以及其组合。可以使用的可能的聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇(PEG)(例如疏水改性的聚亚烷基二醇)、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物(例如疏水改性的聚(氧化烯)共聚物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、有机硅改性(silicone
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modified)的聚醚和聚N异丙基丙烯酰胺及其共聚物。在另一个实施例中，第一相形成聚合物包含聚乙二醇、聚丙二醇或右旋糖酐(dextran)。可以使用的可能的表面活性剂包括但不限于Triton
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X，Triton
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114，Igepal CA
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630和Nonidet P
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40，阴离子表面活性剂，例如羧酸盐、磺酸盐、石油本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从包含核酸和污染物的流体混合物中分离和浓缩靶大小的核酸的方法，所述方法包括：将所述流体混合物与由溶解在第一相溶液和第二相溶液中的第一相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第一双水相系统(ATPS)合并，使得小于靶大小的靶核酸片段分配到所述第二相溶液而污染物分配到所述第一相溶液；提取所述第二相溶液并将其与由溶解在第三相溶液和第四相溶液中的第二相形成聚合物或表面活性剂组分形成的第二ATPS混合，使得所述靶核酸片段分配到所述第三相溶液并在其中浓缩；以及从所述第三相溶液中回收所述浓缩的靶核酸片段。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一聚合物或表面活性剂组分具有比所述第二聚合物或表面活性剂组分更高的分子量。3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的摩尔浓度大于在所述第三相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分、在所述第四相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分以及在所述第二ATPS中的所述第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的摩尔浓度。4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一相溶液中的所述第一聚合物或表面活性剂组分的质量浓度大于在所述第三相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分、在所述第四相溶液中的所述第二聚合物或表面活性剂组分以及在所述第二ATPS中的所述第二聚合物或表面活性剂组分中的至少一种的质量浓度。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二相溶液包含至少一种相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分，其选自由以下组成的组：磷酸二钾、磷酸二氢钾、亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵，含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵，及其组合。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第四相溶液包含至少一种相形成溶解盐、表面活性剂或聚合物组分，其选自由以下组成的组：磷酸二钾、磷酸二氢钾、亲液盐、离液盐、含有阳离子如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵，含阴离子如磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯离子和碳酸氢根的无机盐、NaCl、Na3PO4、K3PO4、Na2SO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠、乙酸铵、镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐、铝盐、溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸钾、硫酸铵，及其组合。7.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比，所述第一ATPS的第二相溶液对所述靶核酸片段施加较弱的排除体积相互作用。8.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二ATPS的第三相溶液相比，所述第一ATPS的第一相溶液对所述靶核酸片段施加较强的排除体积相互作用。9.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比，所述第一ATPS的第二相溶液施加较有利于所述靶核酸片段分配到所述第二相中的亲水/疏水相互作用。
10.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二ATPS的第三相溶液相比，所述第一ATPS的第一相溶液施加较不利于所述靶核酸片段分配到所述第一相溶液中的亲水/疏水相互作用。11.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二ATPS的第四相溶液相比，所述第一ATPS的第二相溶液施加较有利于所述靶核酸片段分配到所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：招彦焘，丹尼尔，
申请(专利权)人：相达生物科技国际有限公司，
类型：发明
国别省市：