一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：1）筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将该特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；2）将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体；3）根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。单双倍体的存在。单双倍体的存在。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
里蜜蜂研究技术，尤其涉及鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法。

技术介绍

[0002]蜜蜂的单倍体胚胎是由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的，蜜蜂的双倍体胚胎是由卵细胞与雄蜂精子结合形成的受精卵发育而来的。蜜蜂单倍体胚胎发育为雄性蜂，即雄蜂；蜜蜂双倍体胚胎发育为雌性蜂，即工蜂或蜂王。
[0003]在蜜蜂社会里，工蜂和雄蜂是对蜂群社会组织和种群繁衍具有重要贡献的两个级型。其中，工蜂是由受精卵发育而来的双倍体蜜蜂，而雄蜂是由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的单倍体蜜蜂，二者在遗传上的差异决定了其生理发育和社会行为的完全不同。工蜂和雄蜂的生长发育期不同，其中工蜂生长发育期为21天，雄蜂为24天。
[0004]工蜂为雌性蜂，不具有生殖能力，主要从事酿蜜、哺育幼蜂、建造巢房、抵御外敌的各种蜂群劳动；而雄蜂作为蜂群中唯一的雄性群体，其唯一使命是与处女蜂王交尾，为蜂群提供一半遗传物质。由受精卵发育而来的双倍体工蜂，与由未受精的卵细胞经过孤雌生殖发育而来的单倍体雄蜂，两者本质差异在于它们各为双倍体、单倍体，这导致它们后续生理结构和职责分工的不同，如雄蜂没有咽下腺、蜡腺、花粉筐等工蜂器官，但其具有敏锐的感知器官（复眼，触角等）、强大的飞行能力以便及时识别蜂王信息素以及追逐蜂王进行空中交尾的能力。
[0005]雄蜂具有独特的遗传育种的优越性。由于双倍杂合体中含有优良性状的隐性等位基因，它会受显性等位基因的制约而不能表达；而雄蜂是单倍体（N=16），它的每个基因仅有一个拷贝，不存在显隐性关系，故其所有基因都可直接选择表达，使得其有益性状的表达频率高于双倍体的蜂王和工蜂，利用单倍体雄蜂进行遗传改良较利用双倍体蜂王和工蜂的速度快33％。雄蜂是蜜蜂基因改良和遗传育种的理想工具。
[0006]通常，工蜂巢房和雄蜂巢房尺寸不一样，后者会比前者大些。请参见图1。正常情况下蜂王会在工蜂巢房里产下双倍体的工蜂卵，在雄蜂巢房里产下单倍体的雄蜂卵。如果蜂王在工蜂巢房里产下的都是双倍体的工蜂卵，说明蜂王授精成功了。而如果在工蜂巢房里检测到有单倍体的雄蜂卵，说明该蜂王精子储备稀缺了，需要被更换了。由此可见，分辨工蜂巢脾里蜜蜂胚胎的单双倍体是判断蜂王产卵状态是否正常的关键。
[0007]识别工蜂巢脾里蜜蜂胚胎的单双倍体，可以快速判断对蜂王的人工授精是否功。处女蜂王在人工授精后，放归至蜂群中，若人工授精成功，蜂王会在工蜂巢房内产下双倍体工蜂卵；若不成功则在工蜂巢房内产下单倍体雄蜂卵，此时则需要重新对蜂王进行人工授精。在生产实践中，夏天长期的高温（40度左右）境况下蜂王体内的精子会失活（或蜂王产卵时间过长，体内精子消耗殆尽），导致无法产下授精的双倍体工蜂卵，而只能产出单倍体雄蜂卵，从而影响蜂群正常发展。此时，若人工介入进行单双倍体胚胎的鉴定，可以指导蜂农判断蜂王产卵状态是否正常，如果发现蜂王状态不正常，则可及时替换蜂王。
[0008]若从表形上分辨蜜蜂的单双倍体胚胎状态，需等到幼虫封盖成蛹之后，亦即产卵后10天（工蜂及雄蜂卵期3天；幼虫期工蜂6天，雄蜂7天）左右的时间。等待时间如此之长，已很不利于科学实验和生产实践的开展。如图1所示，即为用现有的表形方法（用人眼鉴别）进行蜜蜂的单双倍体的模式，其中雄蜂的巢房封盖后高高的很丰满，而工蜂巢房封盖后是齐平的个比较小，由此可识别蜜蜂的单双倍体状态。虽然它能很有效地识别二者，但它是以时间长为代价的，这种时长已远不能满足科研和生产的需要。
[0009]实验室中蜜蜂单双倍体的鉴定方法，目前主要包括直接鉴定法（如染色体计数法）、间接鉴定法（如流式细胞测定法）。其中，染色体计数法，需将收集的蜜蜂胚胎制备成细胞，将细胞进行固定染色，而后在显微镜下进行观察，以分辨单双倍体。采用染色体计数法进行蜜蜂单双倍体胚胎的鉴定时，对胚胎处理的过程复杂，实验室开展实验研究尚可，但在实际生产应用中，蜂农无法利用该方法开展检测。
[0010]刊载在期刊杂志《中国农业科学》2014，47（22）：4533
‑
4539上的一篇论文“中华蜜蜂二倍体雄蜂人工培育及形态测定”，里面提到的蜜蜂单双倍体的鉴定方法是上面提到后一种方法，即间接鉴定法中的一种
ꢀ“
流式细胞测定法”。利用流式细胞仪检测人工室内培育的雄蜂和自然羽化疑似二倍体的雄蜂，取刚羽化的人工培育的雄蜂和疑似二倍体的自然羽化的雄蜂它们的胸部，利用胰酶将其消化成单细胞，处理后进行染色，再上机检测判断单双倍体。使用流式细胞仪进行检测时，因要满足样品上样量，故检测时需要收集约200只蜜蜂胚胎，不仅消耗量大，而且需明确知道目标样品的属性（单倍体/双倍体）；而单双倍体胚胎混合上样根本无法区分哪个样品是单倍体，哪个样品是双倍体。故可见流式细胞检测法不适用于蜜蜂胚胎单双倍体胚胎的鉴定，它只能用来鉴定羽化后的雄蜂的单双倍体。
[0011]在科学研究中，如蜜蜂经人工授精操作后要尽快确定是否对其授精成功，以及在生产中对巢内蜂王产卵状态的优劣，这些关键环节都依赖单双倍体蜜蜂胚胎得到精确快速地检测。传统的表形鉴定方法虽然有效，但在时效性上已经远跟不上科研和生产的迫切需求；而染色体计数法，操作复杂，不利于使用在生产实践中，故而迫切需要一种快速鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，能够解决现有的表形鉴别单双倍体耗时长、染色体计数法鉴别操作复杂的问题，从而既能够适应科学研究的需要，亦能满足对生产实践中蜂农的科学指导。

技术实现思路

[0012]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，能够快速有效地鉴别出蜜蜂单双倍体胚胎。
[0013]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将该特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体。
[0014]优选地，该方法还包括：根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。
[0015]优选地，根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的
存在，具体包括：该被结合的抗体在检测波长390至480nm紫外光的激发下发出蓝色荧光，则鉴别为蜜蜂双倍体胚胎的存在。
[0016]优选地，该方法包括试剂及设备耗材准备之步骤，其中：要准备的试剂包括：1）抗体：购自Abcam公司的合成产品；2）抗体稀释液，含：2g脱脂奶粉 + 100毫升TBST溶液；其中，TBST溶液，含有：TRIS 6.057g，氯化钠8.8g，吐温20溶液500微升，浓盐酸3.1～3.2毫升，并用超纯水定容至1000毫升；3）生理盐水，含有：0.9g NaCl + 100毫升超纯水；要准备的设备耗材有：移虫针、卵固定装置、紫外灯、放大镜；其中，该卵固定装置包括：底部凹陷的凹槽，用于放置所取的卵；在凹槽的顶部配有可连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定蜜蜂单双倍体胚胎的方法，包括：筛选蜜蜂待鉴双倍体胚胎的特异性抗原物质，将所述特异性抗原物质的抗体与该抗原物质结合；将结合有该特异性抗原物质的抗体载有荧光染料，并用一定波长的激光激发该抗体。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，从而鉴别单双倍体的存在。3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据该被结合的抗体在激光激发下的发光情况确定该特异性抗原物质的存在，具体包括：该被结合的抗体在检测波长390至480nm紫外光的激发下发出蓝色荧光，则鉴别为蜜蜂双倍体胚胎的存在。4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，包括试剂及设备耗材准备之步骤，其中：要准备的试剂包括：1）抗体：购自Abcam公司的合成产品；2）抗体稀释液，含：2g脱脂奶粉 + 100毫升TBST溶液；其中，TBST溶液，含有：TRIS 6.057g，氯化钠8.8g，吐温20溶液500微升，浓盐酸3.1～3.2毫升，并用超纯水定容至1000毫升；3）生理盐水，含有：0.9g NaCl + 100毫升超纯水；要准备的设备耗材有：移虫针、卵固定装置、紫外灯、放大镜；其中，所述卵固定装置包括：底部凹陷的凹槽，用于放置所取的卵；在凹槽的顶部配有可连接的开合网状板，用于防止添加抗体溶液后卵浮在液体表面。5.按照权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：房宇，马贝贝，马川，李建科，徐书法，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：