规则粪球菌在制备预防和治疗急性结肠炎的制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了规则粪球菌在制备预防和治疗急性结肠炎的制剂中的应用，所述规则粪球菌菌株购于美国模式培养物集存库(American Type CultureCollection,ATCC)，保藏号：ATCC27759。实验结果表明：在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，规则粪球菌ATCC27759能够显著改善小鼠疾病活跃指数、抑制脾肿大、降低肠道炎症因子的表达；规则粪球菌ATCC27759能够显著增加结肠炎小鼠肠道粘液分泌和紧密连接蛋白的表达而改善肠道屏障功能，并缓解急性结肠炎。该规则粪球菌ATCC27759有潜力开发为预防结肠炎、保护肠道屏障、调理肠道健康的益生菌制剂或功能性食品。制剂或功能性食品。

【技术实现步骤摘要】
规则粪球菌在制备预防和治疗急性结肠炎的制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，具体涉及规则粪球菌在制备预防和治疗急性结肠炎的制剂中的应用。

技术介绍

[0002]结肠炎是一种慢性非特异性炎症性疾病，发病部位涉及回肠、结肠和直肠，临床表现为腹痛、呕吐、腹泻、血便或体重减轻等。由于病因复杂、反复发作、迁延不愈的特点，结肠炎已成为严重影响人类生活健康的一种疾病，加之近年来我国患病人数增加显著，且发病人群呈年轻化的态势，预计到2025年，全国结肠炎患者将达到150万人。而肠道菌群对于保护肠道功能完整，调理肠道健康，维持宿主稳态至关重要。近年来，肠道健康受到重视，肠道微生物研究的热潮也推动了益生菌研究的发展，肠道内的益生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等通过合成多种营养物质促进肠道稳态，抑制致病菌的生长。因此，开发针对性的能够改善或缓解结肠炎的功能益生菌，有助于推动益生菌的研发前景和产业化进程。
[0003]粪球菌属是存在于人体肠道中的梭菌目、毛螺菌科的革兰氏阳性厌氧菌，该菌属可以通过产生短链脂肪酸促进人体健康。规则粪球菌是粪球菌属的模式菌种，是一种专性厌氧菌，形态呈球状，通常成对出现。研究显示，肠道中的规则粪球菌的丰度减少与多种疾病如Ⅱ型糖尿病、乳腺癌和克罗恩病密切相关，服用抗生素环丙沙星也会引起肠道菌群中规则粪球菌的降低。这些发现显示了规则粪球菌有潜力作为评估人类胃肠道健康的微生物生物标志物。但关于规则粪球菌在维护肠道健康、改善急性结肠炎方面尚未报道。

技术实现思路

[0004]基于以上背景，本专利技术的目的在于提供规则粪球菌在制备预防和/或治疗急性结肠炎的益生菌制剂或功能性食品中的应用。
[0005]本专利技术提供规则粪球菌在制备预防和/或治疗急性结肠炎的益生菌制剂或功能性食品中的应用。所述的规则粪球菌(Coprococcus.eutactus)菌株购于美国模式培养物集存库(American Type CultureCollection,ATCC)，保藏号：ATCC27759，产品批号：70036335。
[0006]所述规则粪球菌ATCC27759在含有5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆固体培养基上菌落形态突起，边缘光滑、乳白色、溶血或微溶血。
[0007]所述规则粪球菌ATCC27759在预防和治疗急性结肠炎中的应用，具体是改善结肠炎的疾病状态、抑制炎症因子的表达和保护结肠屏障。所述的规则粪球菌ATCC27759在益生菌制剂中添加的活菌数应高于1
×
109CFU/mL，所述的规则粪球菌ATCC27759在益生菌功能性食品中添加的活菌数应高于1
×
109CFU/g。
[0008]本专利技术的有益效果：通过DSS诱导构建结肠炎小鼠模型，规则粪球菌ATCC27759在含有5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆液体培养基中培养，使菌落数达到109CFU/mL，灌胃小鼠108CFU，实验结果表明：在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，规则粪球菌ATCC27759能够显著改善小鼠疾病活跃指数、抑制脾肿大、降低肠道炎症因子的表达；规则粪球菌
ATCC27759能够显著增加结肠炎小鼠肠道粘液分泌和紧密连接蛋白的表达而改善肠道屏障功能，并缓解急性结肠炎。该规则粪球菌ATCC27759有潜力开发为预防结肠炎、保护肠道屏障、调理肠道健康的益生菌制剂或功能性食品。
附图说明
[0009]图1规则粪球菌ATCC27759菌落形态
[0010]图2规则粪球菌ATCC27759灌胃后结肠炎小鼠疾病活跃指数变化图
[0011]图3规则粪球菌ATCC27759灌胃后DSS诱导的结肠炎小鼠脾脏重量统计图
[0012]图4规则粪球菌ATCC27759灌胃后小鼠肠道炎症因子水平统计图
[0013]图5阿利新蓝
‑
过碘酸西弗染色检测规则粪球菌ATCC27759灌胃后小鼠肠道粘液展示图
[0014]图6 qPCR检测规则粪球菌ATCC27759处理后肠道紧密连接蛋白表达的统计柱状图；
[0015]图1～6中，“*”、“**”表示显著性差异水平，数据以Mean
±
SD形式展现。
具体实施方式
[0016]实施例1：规则粪球菌的复苏和扩大培养
[0017]1、规则粪球菌的复苏
[0018](1)配置胰蛋白胨大豆液体培养基，在121℃高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却至47℃时，加入5％的无菌脱纤维绵羊血，将含有5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆液体培养基置于厌氧培养箱中除去氧气并过夜静置；
[0019](2)安瓿管装的规则粪球菌ATCC27759干粉购自美国模式培养物集存库，产品批号：70036335。在厌氧条件下，向安瓿管中滴加0.5mL灭菌后的含5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆液体培养基将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至盛有4mL液体培养基的试管中混匀，并吸取1滴菌悬液转接至固体培养基上，在37℃、严格厌氧(90％N2、5％CO2和5％H2)的条件下倒置培养12h后观察，发现固体培养基上看到菌落长出，说明菌株活化成功(如图1所示)。
[0020]2、规则粪球菌的扩大培养
[0021](1)取步骤1中的菌落平板，选取单一菌落且生长状态好的菌斑，使用无菌接种环挑取平板上的单一菌斑并接种于步骤1(1)中的含有5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆液体培养基中，在严格厌氧条件下，置于37℃、200rpm/min的摇床中；
[0022](2)摇菌16h后,在厌氧培养箱中取(1)中液体培养基100μL溶于900μL无菌PBS中，标记编号为1，浓度为10
‑1，稀释倍数为101倍；在编号1中吸取100μL溶于900μL无菌PBS中，标记编号为2，浓度为10
‑2，稀释倍数为102倍；重复梯度稀释直至浓度为10
‑8,取10
‑6、10
‑7、10
‑8、浓度涂布于含有5％无菌脱纤维绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板上，每个浓度三个重复，在厌氧培养箱中倒置培养12h；
[0023](3)平板CFU计数：选取(2)中平板菌落生长均匀且单菌落数在10
‑
300之间的平板进行菌落计数，液体培养基中活菌数量为菌落数乘以稀释倍数；最终菌浓度为1x109CFU/mL；
[0024](4)菌液分装与保存：将(3)中计数后的菌悬液吸取1mL置于新的无菌EP管中，4℃8000rpm/min离心10min,离心结束后弃掉上清并使用1mL无菌PBS充分重悬沉淀，待混匀后取吸取100μL到新的无菌EP管中，并于
‑
80℃冰箱保存，保存的菌悬液最终浓度为1x109CFU/mL。分装的菌悬液在
‑
80℃冰箱保存的时间在半年以内。
[0025]实施例2：规则粪球菌改善DSS诱导的结肠炎小鼠疾病活跃指数升高和脾肿大
[0026]1、动物来源：雄性SPF级C57BL/6小鼠，6...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.规则粪球菌在制备预防和/或治疗急性结肠炎的益生菌制剂或功能性食品中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的规则粪球菌保藏号为ATCC27759。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的规则粪球菌ATCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓玉，杨睿鹏，单树花，史江颖，李汉卿，安宁，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：