检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途制造技术

本发明专利技术提供一种利用飞行时间质谱技术快速检测mRNA加帽效率的检测试剂盒，特别是检测mRNA及其核酸疫苗的体外合成质量。本发明专利技术的检测试剂盒包括提供未加帽mRNA和加帽mRNA的mRNA的标准样品和校正内标，使用飞行时间质谱技术从而对mRNA的加帽效率进行相对定量。本发明专利技术首次提出利用飞行时间质谱技术实现对mRNA加帽效率进行检测的方法，操作快速简便，又可通过质谱技术检测微量样本，具有较高的检测灵敏度。敏度。敏度。

【技术实现步骤摘要】
检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，涉及一种利用飞行时间质谱技术快速检测mRNA加帽效率的产品及用途。

技术介绍

[0002]细胞信使RNA(mRNA)的加工修饰包括：5'端形成帽子结构，3'端加PolyA，剪接除去内含子和甲基化。
[0003]成熟的真核生物mRNA的5'端有m7GPPPN结构，称为甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA(鸟嘌呤
‑
7)甲基转移酶和mRNA(核苷
‑
2')甲基转移酶催化形成的。
[0004]不同的甲基可形成3种帽子类型：0、1、2。鸟苷以5'
‑
5'三磷酸键与RNA的5'端相连。当G第7位C被甲基化形成m7GPPPN时，此帽子结构称为“帽子0”。存在于单细胞生物。如果RNA第1位核苷酸的2'
‑
O位也甲基化，形成m7GPPPNm，称为“帽子1”，普遍存在。如果RNA的第1、2位核苷酸的2'
‑
O位均甲基化(2位必须是A)，形成m7GPPPNmNm，称为“帽子2”，次结构发生很少。真核生物帽子的复杂程度与生物进化程度密切相关。
[0005]mRNA5'端帽子结构是翻译起始所必须的，为核糖体识别mRNA提供了信号，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5'
‑
3'核酸外切酶的攻击。
[0006]2020年，新冠疫情的爆发点燃了药企对于RNA赛道的热情。随着国产新冠灭活、腺病毒及重组蛋白疫苗相继获批，mRNA疫苗的进度成为人们关注的焦点。与此同时，后疫情时代的到来也让人们对于RNA疗法的未来充满无限遐想。
[0007]mRNA疗法正成为用于治疗多种疾病的日益重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了优化mRNA的传递和体内蛋白的生成，通常在构建体的5'端需要适当的加帽，其可以防止mRNA的降解并促进mRNA的翻译，因此，加帽效率的准确性对于确定mRNA治疗应用的质量是特别重要的。
[0008]目前常用的加帽效率检测方法有LC
‑
MS法。LC
‑
MS法检测需要做酶切，操作繁琐。难以在临床应用领域进行推广。因此，临床应用领域迫切需要建立一种快速、准确、灵敏的mRNA加帽效率检测方法，为确定mRNA治疗应用的质量、mRNA疫苗的质量研究提供充足的依据。
[0009]中国专利申请CN201480010108.7“信使RNA加帽效率的定量评估”公开了一种利用ELISA测定mRNA加帽的方法。包括：体外合成mRNA，提供含有加帽RNA和未加帽RNA的样品。由于该方法使用常规的处理，尽管其在一定程度上能表征该RNA的特征图谱，但由于其待测物中含有其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体物质而无法推广到其他大量的物质检测中。
[0010]中国专利申请CN201980073219“信使RNA纯化的方法和组合物”公开了用于纯化
mRNA的方法，其涉及通过在包含变性盐与还原剂组合的缓冲液中沉淀体外转录过程(IVT)合成的mRNA，然后捕获沉淀的mRNA以及将捕获的mRNA溶解在溶液中以获得纯化的mRNA，从通过大规模IVT合成的信使RNA制备物中去除杂质。其中，通过HPLC/MS方法测定最终纯化的mRNA产物的帽子种类。然而，该方法需要结合银染凝胶图像法、CE电泳法进行比较分析，整个过程比较繁琐且耗时耗力。
[0011]综上所述，目前拥有测定mRNA产物的帽子种类和效率的方法，主要包括ELISA法、HPLC色谱法、电泳法、荧光素酶法以及RNA斑印法等，这些方法能较好地确定帽子种类，评价加帽效率，但普遍存在过程繁琐、耗时耗力、试剂昂贵等缺陷。
[0012]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix
‑
assisted laser desorption/ionization time
‑
of
‑
flight mass spectrometry，简称MALDI
‑
TOF MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。其质量分析器是一个离子漂移管(ion dirft tube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。
[0013]MALDI
‑
TOF MS检测核酸片段的技术，理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation，CNV)等多种DNA变化类型进行检测。
[0014]此外，基于MALDI
‑
TOF MS，开发的一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。

技术实现思路

[0015]基于上述技术存在的缺陷或不足，本专利技术原理之一在于：首次提供一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
‑
TOF MS)快速检测mRNA加帽效率的方法，该方法能高效针对体外合成的mRNA进行鉴定和分析，包括未加帽mRNA和加帽mRNA，以及对mRNA的加帽效率进行相对定量。
[0016]本专利技术原理之二在于，为了解决质谱检测谱图偏移，本专利技术在检测过程中添加了内标，进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于MALDI TOF
‑
MS检测体外合成的mRNA片段的质谱检测试剂盒，包括mRNA标准样品组合物、内标、纯化试剂、质谱基质、点样芯片、检测软件，其中，所述mRNA标准样品组合物包括：。2.权利要求1所述的质谱检测试剂盒，其中所述内标的核酸序列为5'
‑
CTTGTAAGTTCATTACCTGTATAATTC
‑3’
，分子量为8214.4Da。3.权利要求1或2的所述质谱检测试剂盒，其中所述基质为含有酸性成分的复合基质，包括甲酸、乙酸和柠檬酸。4.权利要求3所述质...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海燕，马庆伟，刘静祎，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：