一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法和培养基技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，本发明专利技术提供了一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法和培养基。本发明专利技术将牡丹种子的种胚接种于牡丹无菌苗培养基，依次进行暗培养和光照培养，得牡丹无菌苗，再将牡丹无菌苗子叶接种于牡丹体细胞胚形成培养基，依次进行暗培养和光照培养，得牡丹体细胞胚。本发明专利技术方法解决了牡丹组织培养过程中污染率高，导致组培材料成活困难，继代增殖缺乏有效的供试材料问题，提高了牡丹组织培养技术的应用效率。了牡丹组织培养技术的应用效率。了牡丹组织培养技术的应用效率。

【技术实现步骤摘要】
一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法和培养基


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，尤其涉及一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法和培养基。

技术介绍

[0002]牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)属芍药科(Paeoniaeeae)芍药属(Paeonia)多年生落叶亚灌木，是著名的观赏、食用及药用植物。
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凤丹
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牡丹(P.ostii
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FengDan
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)因其籽油品质高成为目前新兴的木本油料植物之一。牡丹传统的繁殖方法周期长，不能满足市场需求。因此，加快牡丹组织培养技术的研究，有利于牡丹快速育苗，保存母株的优良性状，为分子生物学育种研究提供基础。
[0003]当前，牡丹组织培养还未建立起成熟稳定的再生体系，主要的瓶颈问题是愈伤组织分化率较低、组培苗生根和移栽成活特别困难。胚性愈伤组织培养是实现体细胞胚胎发生的第一步，体细胞胚发生是愈伤组织离体培养再生的最主要因素，是大规模繁殖的重要手段和遗传转化的理想受体系统。体细胞胚发生有两种方式，一类是直接从组织发育成体细胞胚，为直接体细胞胚发生(direct somatic embryogenesis，DSE)；另一类是需要经过愈伤组织阶段，为间接体细胞胚发生(indirect somatic embryogenesis，IDSE)。直接体细胞胚的发生需要诱导物的合成或抑制物的消除从而恢复细胞分裂，而直接体细胞胚则需要使细胞重新进入细胞周期而进行发育的再决定(葛晓霞.伏令夏橙胚性愈伤组织及其体细胞胚发生的表达谱分析[D].华中农业大学,2011.)。在牡丹组织培养中，愈伤组织大多是分化能力极低的非胚性愈伤组织，且长期继代，愈伤组织胚性易丢失，成熟体胚形成困难，难以再生植株，是严重阻碍牡丹组培再生体系建立的瓶颈问题之一。因此，解决
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凤丹
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牡丹无菌培养体系建立的关键问题之一是成功形成体细胞胚。这是提高
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凤丹
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牡丹遗传转化体系建立的关键。然而，目前还少有合适的成功形成体细胞胚的牡丹培养方法。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供了一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法和培养基，所述方法以牡丹无菌苗的子叶为外植体，配合优化组织培养方式，解决牡丹再生体系建立中的体细胞胚形成困难的关键问题，提高牡丹再生体系建立的进程。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种牡丹无菌苗培养基，所述培养基以MS培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/L，琼脂5～10g/L，NAA0.5～1.0mg
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‑1，6
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BA 0.8～2.0mg
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‑1和活性炭0.5～2.0mg
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‑1，所述无菌苗培养基的pH值为5.8～6。
[0007]本专利技术还提供了一种牡丹体细胞胚形成培养基，所述培养基以MS培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/L，琼脂5～8g/L，TDZ0.2～1.0mg
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‑1和2，4
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D 0.4～1.0mg
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‑1，所述体细胞胚形成培养基的pH值为5.8～6.0。
[0008]本专利技术还提供了一种牡丹体细胞胚形成培养基，所述培养基以MSB培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：葡萄糖20～30g/L，琼脂5～8g/L，TDZ 0.2～1.0mg
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‑1和2，4
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D 0.4～1.0mg
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‑1，所述体细胞胚形成培养基的pH值为5.8～6.0；所述MSB培养基以MS培养基为基础培养基，包括维生素B55～25mg
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‑1。
[0009]本专利技术还提供了一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法，包括如下步骤：
[0010](1)将牡丹种子的种胚接种于牡丹无菌苗培养基，依次进行暗培养和光照培养，得牡丹无菌苗；
[0011](2)将步骤(1)所述的牡丹无菌苗的子叶接种于牡丹体细胞胚形成培养基，依次进行暗培养和光照培养，得牡丹体细胞胚。
[0012]优选的，步骤(1)所述接种前还包括对牡丹种子进行水浸泡和消毒的步骤，所述水浸泡后还包括冲洗的步骤，所述水浸泡的时间为24～48h；
[0013]所述消毒包括依次进行的紫外灯照射、酒精浸泡和升汞浸泡；
[0014]所述紫外灯照射的时间为20～30min，所述酒精的体积浓度为70～80％，所述酒精浸泡的时间为10～30s，所述升汞的体积浓度为0.05～0.15％，所述升汞浸泡的时间为5～10min。
[0015]优选的，步骤(1)中所述暗培养的时间为5～10d；
[0016]所述光照培养的时间为18～30d，所述光照培养的光照强度为2000～3000Lx，所述光照培养的光照周期为15～18h/d；
[0017]所述暗培养和光照培养的相对湿度独立为85～95％，所述暗培养和光照培养的温度独立为24～25℃。
[0018]优选的，步骤(2)中所述接种前还包括对牡丹无菌苗子叶进行预处理的步骤，所述预处理的过程为：将牡丹无菌苗子叶从叶尖起算的2/3部分切取，背部划2～4处划口。
[0019]优选的，步骤(2)中所述接种的接种量为2～8片子叶/每25～35mL培养基。
[0020]优选的，步骤(2)中所述暗培养的时间为5～10d；
[0021]所述光照培养的时间为11～23d，所述光照培养的光照强度为2000～3000Lx，所述光照培养的光照周期为15～18h/d；
[0022]所述暗培养和光照培养的相对湿度独立为85～95％，所述暗培养和光照培养的温度独立为24～25℃。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0024]1、本专利技术以牡丹无菌苗的子叶为外植体，在体细胞胚形成过程中并未发生污染，解决了组织培养过程中污染率高，导致组培材料成活困难，继代增殖缺乏有效的供试材料问题，提高了牡丹组织培养技术的应用效率。
[0025]2、本专利技术在促使体细胞胚形成的培养过程中，改变基础MS培养基中的组成成分(维生素、糖源)，添加不同浓度的不同植物激素组合(2,4
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D、TDZ)，显著提高了牡丹直接体细胞胚形成率，使得愈伤组织更易分化，为后续牡丹再生体系建立的研究提供了良好的供试材料。
[0026]3、本专利技术的牡丹子叶可直接形成体细胞胚，无需经过胚性愈伤组织诱导阶段，直接形成的体细胞胚能够减少牡丹胚性愈伤组织培养困难，且长期继代胚性易失去，导致愈伤组织分化困难的问题，进而提高牡丹再生体系建立的应用效率。
附图说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牡丹无菌苗培养基，其特征在于，所述培养基以MS培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/L，琼脂5～10g/L，NAA 0.5～1.0mg
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BA 0.8～2.0mg
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‑1和活性炭0.5～2.0mg
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‑1，所述无菌苗培养基的pH值为5.8～6。2.一种牡丹体细胞胚形成培养基，其特征在于，所述培养基以MS培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/L，琼脂5～8g/L，TDZ 0.2～1.0mg
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‑1和2，4
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D 0.4～1.0mg
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‑1，所述体细胞胚形成培养基的pH值为5.8～6.0。3.一种牡丹体细胞胚形成培养基，其特征在于，所述培养基以MSB培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：葡萄糖20～30g/L，琼脂5～8g/L，TDZ 0.2～1.0mg
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‑1和2，4
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D 0.4～1.0mg
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‑1，所述体细胞胚形成培养基的pH值为5.8～6.0；所述MSB培养基以MS培养基为基础培养基，包括维生素B55～25mg
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‑1。4.一种培养牡丹子叶直接形成体细胞胚的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将牡丹种子的种胚接种于权利要求1所述的牡丹无菌苗培养基，依次进行暗培养和光照培养，得牡丹无菌苗；(2)将步骤(1)所述的牡丹无菌苗的子叶接种于权利要求2或权利要求3所述的牡...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯小改，张婉青，张红晓，郭丽丽，宋程威，郭琪，张利霞，李昱莹，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：