基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法技术

本发明专利技术涉及一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种核苷酸类似物的核苷酸3

【技术实现步骤摘要】
基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，尤其是一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法。

技术介绍

[0002]测序技术是用于确定核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的一级结构，是生命科学研究的基本工具和获取生物信息数据主要手段，尤其是DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础，使研究人员能够研究并更好地了解健康和疾病，是个性化精准医学范式的必备技术。根据原理的不同，测序技术的发展大致可划分为第一代测序、第二代测序、第三代测序、第四代测序4个历史阶段。由于四代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，因此第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是四代测序技术并存的局面。其中应用最广、发展速度最快的是第二代测序，又称高通量测序，区别于传统的一代测序而言，具有速度快、通量高、成本低的特点。二代测序技术采用克隆扩增和边合成边测序(SBS)的测序化学技术，实现了快速、准确的测序。该过程可在将修饰过带有识别信号基团的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)衍生物整合到核酸链的同时对其进行识别。通常的，每个修饰dNTP的碱基带有可切割链连接的荧光标记，并在3
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OH端加以可切割的保护基团(如叠氮，乙烯基，双硫键基团等，US20010972364；US20130079232A1；US20160040225A1；Ju.J.et al.PNAS， 2006,103,19635
‑<br/>19640)，这种碱基衍生物也就荧光标记可逆终止子核苷酸(NRT)，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。有研究表明(Chen.F.etal.GPB,2013,34
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40；Stupi.B.P.et al.Angew Chem Int Ed Engl,2012,51,1724
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1727； Ondrus.M.et al.NAR.2020,11982
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11993)二代SBS测序方法中影响读长的一个重要原因在于迄今为止开发的可逆终止子核苷酸类似物在切割携带荧光团后，无法将荧光基团和碱基之间的链接基团完全去掉，都会在碱基处残留约一定长度的小分子基团(如乙二醇修饰的炔丙基氨基部分)，并随着每一轮的SBS不断的在新形成的DNA双链上累积，到一定程度后，这些残基可能足以干扰DNA双螺旋结构的稳定性和二级结构,从而影响DNA聚合酶对其的识别进而终止链增长反应，限制测序读段长度。为此，有研究者设计了单修饰可逆终止子 (MRT)，即把可逆阻断保护基团和荧光基团同时修饰3'
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0H基团上,该修饰可以起到双重作用,既为荧光信号的报道子又作为可逆终止子,该修饰方式理论上可以成功的避免采用NRT 测序时在碱基上留下的残基,从而降低对DNA双链稳定性以及聚合酶识别等影响,以提高测序的读长。这种方法的主要挑战是,由于在由聚合酶与互补核苷酸和DNA模板形成的复合物状态下,核苷酸的3
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OH位置非常靠近DNA聚合酶的活性位点处的氨基酸残基,因此DNA聚合酶难以接受3
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0大分子染料修饰的核苷酸作为底物。

技术实现思路

[0003]针对现有的不足，本专利技术提供一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试
剂及方法。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT 基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3
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位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3
′‑
OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，
[0005]化合物1是不能发岀荧光信号或不带有荧光基团的核苷酸衍生物；
[0006]化合物2是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；
[0007]化合物3是携带有环境高敏荧光基团的核苷酸衍生物，在一种条件下不能发岀荧光信号或能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号不同，在另一种条件下能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号相同，所述环境高敏荧光基团的结构与化合物2中的荧光基团的结构不同；
[0008]化合物4是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物4是能够发岀与化合物2相同的荧光信号，但携带有与化合物2不同的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团能在一定条件下可断裂移除，此条件对化合物2没有影响。
[0009]作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I) 或式(II)或式(III)结构的化合物，
[0010][0011]其中，是非共价键；
[0012]B代表不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物是指腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶 (C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其类似物；
[0013]R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团；
[0014]R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护性基团；
[0015]R3各自独立地选自卤素、
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H、
‑
OH、N3或C2
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C10柔性链；
[0016]L为可切割连接基团或不存在；
[0017]R4各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。
[0018]R5各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团。
[0019]作为优选，所述碱基或类似物是如下任意一种结构的化合物，
[0020][0021]作为优选，所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3
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OH修饰基团；所述可切割连接基团是指链接3
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OH和环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应性基团之间的小分子基团；所述能发出相同荧光信号的荧光基团是在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。
[0022]作为优选，所述保护基团是具有如下任意一种结构的基团：
[0023][0024]所述可切割连接基团如下任意一种结构的基团：
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3
′
位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3
′‑
OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，化合物1是不能发岀荧光信号或不带有荧光基团的核苷酸衍生物；化合物2是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；化合物3是携带有环境高敏荧光基团的核苷酸衍生物，在一种条件下不能发岀荧光信号或能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号不同，在另一种条件下能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号相同，所述环境高敏荧光基团的结构与化合物2中的荧光基团的结构不同；化合物4是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物4是能够发岀与化合物2相同的荧光信号，但携带有与化合物2不同的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团能在一定条件下可断裂移除，此条件对化合物2没有影响。2.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)或式(III)结构的化合物，其中，
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是非共价键；B代表不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物是指腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其类似物；R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团；R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护性基团；R3各自独立地选自卤素、
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H、
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OH、N3或C2
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C10柔性链；L为可切割连接基团或不存在；R4各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。R5各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团。
3.根据权利要求2所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述碱基或类似物是如下任意一种结构的化合物，4.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3
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OH修饰基团；所述可切割连接基团是指链接3
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OH和环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应性基团之间的小分子基团；所述能发出相同荧光信号的荧光基团是在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。5.根据权利要求4所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述保护基团是具有如下任意一种结构的基团：所述可切割连接基团如下任意一种结构的基团：双硫链基团氰乙基链基团叠氮链基团二烷基缩酮链基团烯丙基链基团1
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(4，4
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二甲基
‑
2，
6
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二氧代亚环已
‑1‑
基)乙基链基团硝基苄基链基团偶氮链基团其中R1’
,R2’
各自独立地选自卤素，
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H，C1
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C5脂肪链；所述能发出相同荧光信号的荧光基团来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF 594、AF 555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO 495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor 488、iFluor 514、iFluor 532、iFluor 546、iFluor 555、iFluor 568、iFluor 590、iFluor610、iFluor 633、iFluor 647、iFluor 680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670。6.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述环境高敏荧光基团选自环境高敏荧光染料，所述环境高敏荧光染料是pH值敏感荧光染料。7.根据权利要求6所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述pH值敏感荧光染料是包括如下任意一种结构式的化合物，其中：X各自独立地选自卤素、
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H、
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OH、N3、NH2、S、Si或C2
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C10柔性链；R6各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1
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C10饱和烷...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鑫，卓少春，冯越，周蓉，伍建，
申请(专利权)人：深圳铭毅智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：