一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物及方法技术

本发明专利技术公开了属于植物病原菌抗药性检测技术领域的一种检测灰霉菌苯并咪唑抗药性的组合物及方法，所述组合物，包括检测灰霉菌的引物对，所述引物对的序列为：上游引物：5

【技术实现步骤摘要】
一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物及方法


[0001]本专利技术属于植物病原菌抗药性检测
，具体涉及一种检测灰霉菌苯并咪唑抗药性的组合物及方法，用于田间抗性菌株的快速检测。

技术介绍

[0002]灰葡萄孢菌寄主范围极广，可造成多达200种植物的灰霉病，被列入世界十大重要植物病原菌，且排名第二(Dean et al.2012)。灰霉病在植物生长期间、采后贮藏及运输过程中均可发生。近年来，随着避雨栽培技术的推广，我国葡萄产业发展迅速，但伴随着设施栽培面积的提升，葡萄灰霉病也逐渐上升为葡萄上的主要病害之一。该病害可引起葡萄植株从幼芽、新梢、花序、幼叶、直到果实的腐烂；成熟期时，可形成灰色霉层；贮藏期时，可导致葡萄穗轴部湿腐。严重时，造成病穗率可到50％-80％，甚至导致个别果园绝收(钱恒伟et al. 2015)。
[0003]目前，对该病害最主要有效的防治方法依然依赖化学防治，苯并咪唑类(MBC)在杀菌剂中占有重要位置，包括品种有多菌灵、丙硫多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、麦穗宁等。但灰霉病菌由于其具有极高的遗传多样性(Pierre et al.2002)，能大量产孢，每个世代时间短 (Petsikos-Panayotarou et al.2003)，并具有广泛的寄主(Yourman et al. 2008)，导致其很容易产生杀菌剂抗药性，杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)将灰霉评定为一种易产生抗药性的高风险病原菌。检测灰霉菌群体内抗药性菌株出现的频率不仅为合理选择农药控制病害发生提供技术支持，也为延缓抗药性菌株的发展，防治抗药性病害流行危害提供有力保障。大量研究结果表明，病原真菌对苯并咪唑类药剂抗性的产生主要是因为第VII连锁群上的β微管蛋白(β-tubulin)基因 (TUB2)的点突变，该基因转录翻译的蛋白的第198位谷氨酸点突变成丙氨酸(E198A)，会导致灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂高度抗药性的产生。因此，建立灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性的快速检测技术，在灰霉病菌抗药性治理中显得尤为重要。
[0004]目前，常用的抗药性检测方法主要分为基于基因突变的PCR技术，以及以菌丝生长抑制为基础的传统菌落直径法。传统的菌落直径法需要将田间采集的病原菌在无菌环境下进行纯培养，并在一系列含不同药剂浓度的培养基上进行培养，检测并计算农药对病原菌的抑制中浓度(EC
50
)，或最低抑制浓度(MIC)。但该方法需要时间周期长，工作量大，且测定样本数量有限，难以在病害发生早期就发现抗药性菌株的存在。基于基因突变的PCR技术则根据已知的导致抗药性产生的点突变设计相应引物，但其所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在地市县等农业部门推广。
[0005]重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)技术和传统PCR方法相比，该法具有扩增效率更高，不需昂贵仪器，特异性好等特点，且该法适用于常规反应温度。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物，包括检测灰霉菌的引物对，所述引物对针对灰霉病菌的TUB2基因。在设计了可区分敏感和E198A导致的抗性菌株的一系列RPA引物，并通过实验对多设计的引物进行优化筛选，获得了一对用于RPA检测灰霉菌对MBC类杀菌剂抗药性菌株的专用引物对。
[0007]所述引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，具体为：
[0008]上游引物：5
’-
GTCCATCAATTGGTTGAGAACTCTGAAAC-3
’
；
[0009]下游引物：5
’-
GCAAATCCAACCATGAAGAAATGGAGACG
ꢀ-3’
。
[0010]本专利技术的目的还在于提供一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的试剂盒，所述试剂盒包括上述组合物。
[0011]上述试剂盒中，所述上游引物的5
’
端添加有FAM，所述下游引物的5
’
端添加有Biotin。
[0012]其中，FAM表示羧基荧光素，Biotin代表生物素。
[0013]上述试剂盒中，所述引物对在扩增时的终浓度为0.2μM。
[0014]上述试剂盒中，还包括标准阳性对照DNA，缓冲液、RPA扩增酶体系和侧流层析试纸条。
[0015]上述试剂盒中，所述RPA扩增酶体系包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助聚集蛋白、核酸内切酶。
[0016]上述试剂盒中，所述侧流层析试纸条包括依次排列的样品垫、结合垫、判读区和吸收垫；
[0017]所述结合垫包括金标抗体，例如，所述结合垫为金标链霉亲和素；
[0018]所述判读区包括质控线和检测线；
[0019]所述检测线包括抗荧光素抗体，例如，所述抗荧光素抗体为小鼠抗荧光素单克隆抗体，所述质控线包括BSA生物素。
[0020]上述试剂盒中，还包括裂解液。
[0021]本专利技术还提供了上述组合物或上述试剂盒在检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种检测灰霉菌苯并咪唑抗药性的方法，包括以下步骤：
[0023](1)提取待测样本DNA；
[0024](2)以DNA为模板，进行RPA扩增，其中，上游引物为：5
’-ꢀ
GTCCATCAATTGGTTGAGAACTCTGAAAC-3
’
；下游引物为： 5
’-
GCAAATCCAACCATGAAGAAATGGAGACG-3
’
；所述上游引物的5
’
端添加有修饰基团FAM，所述下游引物的5
’
端添加有修饰基团 Biotin；
[0025](3)应用侧流层析纸条进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有苯并咪唑抗药性灰霉菌株；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有苯并咪唑抗药性灰霉菌株。
[0026]上述方法中，步骤2)中，所述RPA扩增的方法包括：将RPA 扩增酶体系和Buffer A混合，加入上游引物和下游引物，并加入待测样本DNA，然后加入Buffer B混合均匀，离心，
进行反应。
[0027]上述方法中，步骤2)中，所述RPA扩增的反应体系为：BufferA 29.4μl，10μM的上游引物1.0μl，10μM的下游引物1.0μl，样本DNA 1.0μl；Buffer B 2.5μl，无菌水补足至50μl；反应条体为：5000 *g离心10s，25-40℃反应10-30min。
[0028]上述方法中，可以从待测植株或待测病原菌菌丝中免培养提取得到病原菌DNA。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的组合物，其特征在于，包括检测灰霉菌的引物对，所述引物对的序列为：上游引物：5
’-
GTCCATCAATTGGTTGAGAACTCTGAAAC-3
’
；下游引物：5
’-
GCAAATCCAACCATGAAGAAATGGAGACG-3
’
。2.一种检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的5
’
端添加有FAM，所述下游引物的5
’
端添加有Biotin。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对在扩增时的终浓度为0.2μM。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照DNA，缓冲液、RPA扩增酶体系和侧流层析试纸条。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述侧流层析试纸条包括依次排列的样品垫、结合垫、判读区和吸收垫，所述结合垫包括金标抗体，所述判读区包括质控线和检测线，所述检测线包括抗荧光素抗体，所述质控线包括BSA生物素。7.权利要求1-2任一项所述的组合物或权利要求3-6任一项所述的试剂盒在检测灰霉菌苯并咪唑类杀菌剂抗药性中的应用。8.一种检测灰霉菌苯并咪唑抗药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑宁，袁会珠，杨代斌，闫晓静，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：