本发明专利技术公开了一种皮肤年轻化蛋白标志物—LX15B蛋白及其无创性提取方法。公开了LX15B蛋白在辅助判断皮肤年轻化程度中的提取检测方法及应用，旨在从根源上找到皮肤年轻化的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，保持年轻化皮肤，另外可以正确判断皮肤的皮肤年轻化程度以及判断皮肤年轻化的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向。学美容提供参考和方向。学美容提供参考和方向。
【技术实现步骤摘要】
一种皮肤年轻化蛋白标志物
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LX15B蛋白及其无创性提取方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种皮肤年轻化蛋白标志物—LX15B蛋白及其无创性提取方法。
技术介绍
[0002]皮肤年轻化的标准：是皮脂分泌量适中,皮肤既不干也不油,肤色红润细腻,富有弹性,厚薄适中,毛孔较小,对外界的刺激不敏感,PH值为5
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5.6。
[0003]随着人们生活水平的提高，人们越来越重视皮肤保养，但通常只是关注皮肤衰老的外在表现，比如皱纹、色斑、以及毛孔粗细程度等信息，并由此来判断皮肤的年轻程度，这种判断皮肤年轻程度的方法不能从根源上找到保持皮肤年轻化的原因，无法在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外正确判断皮肤的年轻程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，也是美容或者医学美容的前提。
[0004]LX15B是结构相关的非血红素铁双加氧酶的脂加氧酶家族的成员，参与脂肪酸氢过氧化物的产生，将花生四烯酸(AA)转化为15S
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氢过氧二碳四烯酸/(15S)
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HPETE。它还作用于亚油酸以产生13
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羟基十八碳二烯酸/13
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HPODE。AA在表皮疾病的发展中起着重要作用，并且可以通过COX
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1和COX
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2合成前列腺素家族。AA还可以通过5
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脂氧合酶合成白三烯家族。许多皮肤疾病与前列腺素或相关化合物有关。PGD2和PDE2与炎症有关，可以促进皮肤毛细血管扩张和红斑生成。B4(LTB4)也是一种众所周知的炎症因子，可通过其受体B白三烯受体1(BLT1)促进耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。此外，白三烯B4(LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysLTs)的5
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脂氧合酶(5
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LO)产物抑制作用可调节炎症反应并改善皮肤伤口愈合。作为脂氧合酶家族的成员，LX15B在AA代谢中起重要作用，减少AA在表皮中的过度积聚，大大降低炎症反应，并且对维持皮肤屏障功能至关重要。同时，LX15B可以生成亚油酸，生成13
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羟基十八碳二烯酸/13
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HPODE，该过程可用于调节皮肤细胞的分化，最终形成合适的防水层，因此维持正常的皮肤屏障功能。
[0005]目前没有将LX15B蛋白(B型花生四烯酸15
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脂加氧酶)用于辅助判断皮肤年轻程度的先例。
技术实现思路
[0006]一种无创提取皮肤中LX15B蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；
[0008](2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；
[0009]2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；
[0010]3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；
[0011]4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。
[0012]优选地，表皮皮肤样本中LX15B蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；
[0013](2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；
[0014]2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；
[0015]3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；
[0016]4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；
[0017](3)检测
[0018]将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过ULX15B蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：
[0019]分离：0
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5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5
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160min，流动相B从5％线性升至35％；160
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170min，流动相B从35％升至80％；170
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175min，80％流动相B；176
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180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；
[0020]DDA质谱检测
[0021]经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q
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Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5；
[0022]DIA质谱检测
[0023]经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q
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Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350
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1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种无创提取皮肤中LX15B蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：表皮皮肤样本中LX15B蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；(3)检测将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过ULX15B蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：分离：0
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5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5
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160min，流动相B从5％线性升至35％；160
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170min，流动相B从35％升至80％；170
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175min...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨森，张学军，张博，
申请(专利权)人：杨森，
类型：发明
国别省市：
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