一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒。该试剂盒包括：包被有猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白的酶标板、HRP标记的鼠抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体、阳性血清对照、阴性血清对照。该试剂盒最低能检出1:512稀释的阳性血清，并且与PEDV、TGEV和PDCoV等阳性血清无交叉反应，批内和批间重复变异系数小于10%。与间接免疫荧光试验的对比结果显示，本发明专利技术阻断ELISA试剂盒检测的符合率为99.6%，Kappa值为0.91，本发明专利技术建立的阻断ELISA方法与IFA高度一致。该方法操作简便、快速，可用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体临床样本。临床样本。临床样本。

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒。

技术介绍

[0002]猪急性腹泻综合征(swineacutediarrheasyndrome，SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(swineacutediarrheasyndromecoronavirus，SADS
‑
CoV)引起的一类急性传染病。临床表现主要有感染仔猪急性腹泻、呕吐，5日龄内新生仔猪由于体重骤减和严重脱水而迅速死亡，且死亡率高达90％以上。SADS
‑
CoV是由我国学者在2017年，广东省某猪场发生仔猪严重腹泻粪便样品中分离得到的。SADS
‑
CoV是一种新型的猪肠道冠状病毒，与蝙蝠来源的HKU2核苷酸序列同源性达到90％以上，与人冠状病毒229E/NL63进化距离也较近，且二者均可利用人的血管紧张素转化酶2(ACE2)作为入侵受体，说明SADS
‑
CoV具有跨种传播到人类的潜在威胁。鉴于当前没有有效的疫苗和抗病毒药物可用，SADS的快速准确诊断对于该病的防控具有十分重要的意义。
[0003]SADS
‑
CoV属于冠状病毒科、Alpha冠状病毒属，是具有囊膜的、单股正链RNA病毒。SADS
‑
CoV基因组大小约为27kb，5
′
端有帽子结构，3
′
端有Poly(A)尾。刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)是SADS
‑
CoV的四个结构蛋白。N基因编码区长度为1128个碱基，共编码375个氨基酸，蛋白分子质量约为41.7ku。N蛋白具有较好保守性，其免疫原性强，且在病毒感染的整个过程均有表达，能诱导机体产生中和抗体，是病毒血清学诊断和免疫学检测的关键蛋白。
[0004]酶联免疫吸附试验(ELISA)因具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，已经广泛应用于人畜疾病的检测。目前市场上还没有商品化的SADS
‑
CoV检测试剂盒。Peng等将纯化的SADS
‑
CoVS蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法(Peng,P.,Gao,Y.,Zhou,Q.,Jiang,T.,Zheng,S.,Huang,M.,Xue,C.,Cao,Y.,Xu,Z.,2021.DevelopmentofanindirectELISAfordetectingswineacutediarrhoeasyndromecoronavirusIgGantibodiesbasedonarecombinantspikeprotein.Transboundaryandemergingdiseases)。与间接免疫荧光试验(IFA)相比，阳性临床样品的符合率为97.8％，阴性临床样品的符合率为94.7％。该方法对于包被抗原的要求比较高，否则容易出现假阳性和假阴性。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于SADS
‑
CoVN蛋白特异性单克隆抗体建立了检测SADS
‑
CoV血清抗体的阻断ELISA试剂盒，相对于间接ELISA方法，该方法对于包被抗原的纯度要求较低，而检测方法具有更强的特异性，以及更高的灵敏度优势。
[0006]本专利技术的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，包括：
包被有SADS
‑
CoV N蛋白的酶标板、HRP标记的鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体。
[0007]其中，SADS
‑
CoV N蛋白的制备方法为：根据SADS
‑
CoV GDS04毒株N蛋白(Genbank 登录号：MF167434.1)为参考，设计特异性引物，通过PCR扩增获得N基因，将其与原核表达载体pET32a连接，构建重组质粒pET32a
‑
N，转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导表达获得N蛋白，然后使用镍柱纯化获得纯化的N蛋白。所述的SADS
‑
CoV N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码SADS
‑
CoV N蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:12所示。
[0008]更进一步的，所述鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将纯化的N重组蛋白作为免疫源，按30μg/只的量免疫Balb/c小鼠。首次免疫，将N蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点背部皮下注射。每隔2周进行加强免疫，共免疫四次。加强免疫是将N重组蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。第四次免疫后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和IFA验证，筛选得到阳性克隆，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞注射小鼠进行腹水的制备，进而得到抗鼠SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体。
[0009]所述鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。其中，重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其中，轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQID NO:6所示的CDR3。
[0010]编码鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；编码鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
[0011]本专利技术的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，还包括阳性对照血清和阴性对照血清。
[0012]所述的阳性对照血清为猪急性腹泻综合征冠状病毒人工免疫后采集的猪血清；所述的阴性对照血清为无猪急性腹泻综合征冠状病毒病原体的猪血清。
[0013]本专利技术的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，还包括包被液、封闭液、、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液以及终止液。
[0014]所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液(1.5g Na2CO3，2.92gNaHCO3，定容于1L去离子水中，pH调至9.6后得到)样品稀释液为1％BSA[0.9％NaCl，0.5％Tween
‑
20， 0.05％mol/LMOPS(pH7.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标抗体；其中，酶标板包被有SADS
‑
CoV N蛋白，酶标抗体为HRP标记的鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体；鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。2.根据权利要求1所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述的SADS
‑
CoV N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。3.根据权利要求1所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。4.根据权利要求3所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，编码鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；编码鼠抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。5.根据权利要求1～4任一项所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清；所述的阳性对照血清为猪急性腹泻综合征冠状病毒人工免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，曹丽艳，郑海学，田宏，孔祥雨，袁聪，段月月，索学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院都市农业研究所，
类型：发明
国别省市：