与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于作物育种学领域，涉及一种与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记及其应用。所述的KASP标记与Pm58基因的遗传距离为0 cM。本发明专利技术在国际上首次获得了与Pm58最为紧密连锁的分子标记。Xkasp68500为共显性标记，具有高通量、高效率、扩增稳定、检测方便等优点。用标记Xkasp68500检测Pm58基因，可以确定Pm58的存在与否以及存在状态，进而快速筛选出携带有Pm58的植株并用于抗白粉病小麦新品种的选育。育。育。

【技术实现步骤摘要】
与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于作物育种学领域，涉及一种与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]小麦是世界上最重要的粮食作物之一，为全球人口提供了约20%的能量。由禾本科布氏白粉菌小麦专化型（Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt）引起的小麦白粉病在很大程度上危害了小麦的生产。小麦感染白粉病后，光合作用速率下降，分蘖数、穗粒数及千粒重等降低，从而影响了小麦产量，严重时可导致小麦减产30%以上（Singh et al. 2016）。相比于喷洒化学药剂，培育和种植抗病品种是最经济有效、可持续解决小麦白粉病危害的重要手段之一（Kang et al. 2020）。节节麦（Aegilops tauschii Coss., 2n=2x=DD）是普通小麦D基因组的供体，蕴含着丰富的抗病、抗虫和抗逆优异等位基因，是小麦遗传改良进程中具有重要利用价值的小麦近缘种（Kishii 2019）。因此，发掘节节麦中的抗白粉病基因，并通过分子标记辅助选择将其回交导入到普通小麦中加以利用，这对于拓宽小麦白粉病抗性的遗传基础，减缓由于病原菌和寄主协同进化而导致的抗性丧失具有重要意义。
[0003]节节麦是山羊草属中地理分布最广的物种，西起里海南部海岸和土耳其，东至阿富汗和中亚，适应多种环境条件（Majka1 et al. 2017）。节节麦基因组中至少包含1762个抗病基因类似物（Luo et al. 2017），为抵抗病原菌的入侵提供了大量潜在的抗病基因位点。目前从节节麦中鉴定到的抗叶锈病基因有Lr21、Lr22a、Lr32、Lr41、Lr42等，抗秆锈病基因有Sr33、Sr45、Sr46等，抗条锈病基因有Yr28等，抗白粉病病基因有Pm2a、Pm19、Pm34、Pm35、Pm58等（Kishii 2019）。尽管来自小麦野生近缘种的抗病基因大都具有广谱抗病性，但由于连锁累赘的影响，在育种上要有效利用这些基因非常困难。因此，迫切需要对这些抗病基因进行精细定位和克隆，并开发共分离分子标记用于小麦抗病分子育种。
[0004]Pm58来自阿塞拜疆节节麦TA1662，前人将其定位到了2DS染色体上的一个8.6
‑
Mb的标记区间内（Wiersma et al. 2017）。胡闪闪（2021）利用来自我国河南的感病节节麦T093与TA1662杂交构建F
2:3
分离群体，对Pm58进行了精细定位。Pm58被定位到一个相距602.8
‑
kb的Xhnu670
–
Xhnu186区间内，在2DS染色体上的物理位置为14,761,707
–
15,364,537 bp。
[0005]竞争性等位基因多态性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR, KASP）是一种高通量、高效率的分子标记，可以对基因组DNA中广泛存在的SNP（single nucleotide polymorphisms）和InDel（insertion
‑
deletion polymorphisms）变异进行精准的分型。该技术利用两条末端碱基不同的等位基因特异引物和一条共同引物进行PCR扩增。末端碱基不同的两条引物分别携带荧光接头序列FAM和HEX。根据扩增产物所携带的不同的荧光信号，可以快速对大量样本进行检测，准确判断其基因型，非常适合用于分子标记辅助选择育种。
[0006]因此，筛选出与节节麦抗白粉病基因Pm58共分离的SNP，并开发成易于检测的KASP标记，应用于小麦抗病基因聚合和分子育种，这对拓宽小麦白粉病抗性的遗传基础具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术提出一种与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记及其应用，解决了由于连锁累赘导致小麦野生近缘种中的优异抗病等位基因在小麦育种中难以利用的问题。
[0008]本专利技术的技术方案是这样实现的：与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记，所述KASP标记与Pm58基因的遗传距离为0 cM。
[0009]所述KASP分子标记为共显性分子标记Xkasp68500。
[0010]所述KASP分子标记是根据参考基因AET2Gv20068500的第869位核苷酸变异开发得到。
[0011]本申请的KASP标记是通过以下方法获得的：一、F2群体的构建与Pm58区段重组体的筛选（1）感白粉病亲本T093（
♀
）与抗白粉病亲本TA1662（
♂
）进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2大群体；（2）用CTAB法提取F2群体中各单株的DNA；利用Pm58的边界标记Xhnu670和Xhnu186筛选F2群体中在该区段发生重组的单株。所用引物的序列信息如下：表1 引物序列信息二、F2代重组体自交后代的白粉病抗性鉴定对每个F2代重组体的自交后代进行白粉病抗性鉴定；鉴定于植物生长箱中进行，从每个F2代重组体的自交后代中随机选择25粒种子，种植于50孔的穴盘中；在一叶一心期，利用白粉菌流行菌株E09进行接种，5
‑
7天后按0
‑
4级的分级标准调查各个单株的抗病反应型；小麦生长条件设置为16小时光照，8小时黑暗，光照时温度为22℃，黑暗时温度为18℃。
[0012]三、分子标记分析（1）用CTAB法提取抗病亲本TA1662、感病亲本T093和F2代重组体的DNA；利用BGISEQ
‑
500测序平台对TA1662和T093进行了基因组重测序（PE150），测序深度为20倍。利用BWA工具将所有高质量序列比对到节节麦AL8/78参考基因组后，再利用GATK软件进行SNP和InDel变异检测。挑选位于Pm58所在的Xhnu670
–
Xhnu186区间内的SNP变异，结合AL8/78参考序列（Luo et al. 2017）开发KASP标记，并进行多态性筛选。
[0013]（2）选择在亲本间及F2群体中有多态的KASP标记及两侧SSR标记Xhnu670和Xhnu186扩增F2代重组体的DNA，获得各个重组体的标记基因型资料。
[0014]所述SSR标记采用的PCR扩增方法：PCR反应体积为25 μL，其中2
×ꢀ
Taq Plus Master Mix II (Vazyme, Nanjing, China) 12.5 μL，10 μM引物各1.0 μL，模板DNA 150 ng，加水至25 μL；PCR扩增程序为95℃预变性 3分钟，95℃变性15s，55
‑
60℃退火20s，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸5分钟；在PTC
‑
225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后银染、照相，记录结果。
[0015]所述KASP标记采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与抗白粉病基因Pm58共分离的KASP分子标记，其特征在于：所述KASP标记与Pm58基因的遗传距离为0 cM。2.根据权利要求1所述的KASP分子标记，其特征在于：所述KASP分子标记为共显性分子标记Xkasp68500。3.根据权利要求1所述的KASP分子标记，其特征在于：所述KASP分子标记是根据参考基因AET2Gv20068500的第869位核苷酸变异开发得到。4.利用权利要求1
‑
3任一项所述的KASP分子标记鉴定节节麦抗白粉病基因Pm58的方法，其特征在于，步骤如下：以待测节节麦的DNA为模板，以KASP分子标记Xkasp68500的等位基因特异引物和共同引物为引物，进行PCR扩增，并检测扩增产物所携带的荧光信号，通过荧光信号判断是否携带节节麦抗白粉病基因Pm58。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述KASP分子标记Xkasp68500的引物包括等位基因特异引物Xkasp68500
‑
FAM
‑
F和Xkasp68500
‑
HEX
‑
F以及共同引物Xkasp68500
‑
R；其中Xkasp68500
‑
FAM
‑
F序列如SEQ ID NO.1所示，Xkasp68500
‑
HEX
‑
F序列如SEQ ID NO.2所示，Xkasp68500
‑
R序列如SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求4所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛树林，王新天，王映雪，孙铁鹏，马钰彧，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：