一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法及冻干保护液技术

本发明专利技术公开了一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法及冻干保护液。一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法，所述生物分子或细胞富集筛网包括筛网骨架、覆于所述筛网骨架上的高分子层及包被与所述高分子层上的能够目标生物分子活细胞特异性结合的抗体，包括如下步骤：将包被有高分子层的筛网置于冻干保护液中，所述冻干保护液浸没所述筛网，其中，所述冻干保护液包括赋形剂、增稠剂及防腐剂，其中，所述赋形剂包括重量比为4～6∶1～3∶2～3的糖类、甘露醇和山梨醇；冻干保存，使筛网被包裹在由所述冻干保护液形成的冻干粉中。本发明专利技术冻干后的富集筛网无致密糖壳，具有较优的复溶性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法及冻干保护液


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法及冻干保护液。

技术介绍

[0002]目前，微流控技术已应用于CTC细胞(循环肿瘤细胞)分选富集，其中富集芯片是重要的组成元件，其中的一种富集芯片为包被有能够和目标分子或细胞特异性结合的抗体的网状芯片。江苏汇先医药技术有限公司的CytoBot2000仪所使用的的一次性耗材TIP头即内置这种网状芯片，网状芯片表面结合有高分子涂层及低浓度的捕获抗体，这些组分的化学稳定性及结构稳定性较差，在大规模生产贮存过程中需要对其进行基于冻干工艺的保护。然而在冻干过程中，网状芯片及其表面高分子涂层及蛋白组分易收到物理形变，致使其表面包被的高分子及捕获抗体脱落或捕获抗体活性受损。为保证网状芯片结合的高分子涂层及捕获抗体的结构及活性稳定，在网状芯片冻干过程中袭用传统蛋白组分的冻干保护剂配方(即高浓度的塑型剂蔗糖+渗透压维持剂Tris
‑
甘氨酸缓冲液)，但该款冻干保护剂在小规模的研发生产中遇到了以下问题：1)塑型剂蔗糖浓度过高，冻干后形成致密糖壳；2)冻干后的芯片暴露在空气中组装易吸水潮解形成高粘度的烫液；3)芯片在后续使用的复溶过程中糖液难以清洗，导致下游应用结果判读受阻。综合上述问题基于该款冻干保护剂的网状芯片在冻干后的组装生产，及后续使用的复溶过程中均面临巨大挑战。

技术实现思路

[0003]针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法，冻干后的富集筛网无致密糖壳，具有较优的复溶性。
[0004]本专利技术的另一目的是提供一种冻干保护液，其适于对生物分子或细胞富集筛网进行冻干保护，且冻干后为粉状干物质，具有较好的崩解性，进而复溶性较好。
[0005]根据本专利技术的一个方面，一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法，所述生物分子或细胞富集筛网包括筛网骨架、覆于所述筛网骨架上的高分子层及包被与所述高分子层上的能够目标生物分子活细胞特异性结合的抗体，包括如下步骤：
[0006]将包被有高分子层的筛网置于冻干保护液中，所述冻干保护液浸没所述筛网，其中，所述冻干保护液包括赋形剂、增稠剂及防腐剂，其中，所述赋形剂包括重量比为4～6∶1～3∶2～3的糖类、甘露醇和山梨醇；
[0007]冻干保存，使筛网被包裹在由所述冻干保护液形成的冻干粉中。
[0008]在一实施例中，所述糖类、甘露醇和山梨醇的重量比为5～6∶1～2∶3。优选地，甘露醇和山梨醇的重量比为3∶2。更优选地，糖类重量与甘露醇和山梨醇的重量之和的比大致为1∶1。进一步地，所述糖类、甘露醇和山梨醇的重量比为5∶3∶2。
[0009]在一实施例中，所述糖类包括选自蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或多种的组合。
[0010]在一实施例中，所述增稠剂包括聚乙烯吡咯烷酮。优选地，所述增稠剂为PVP
‑
K30。进一步地，增稠剂和助溶剂溶解于无菌水中配制为重量浓度为1～3％的增稠剂溶液，备用。其中，助溶剂为吐温80。更进一步地，该增稠剂在冻干保护液中的体积百分比为5～15％。
[0011]在一实施例中，所述防腐剂包括硫柳汞和/或叠氮钠。优选地，所述防腐剂为硫柳汞。进一步地，防腐剂溶解液于水中配制为重量浓度为0.01～0.1％的防腐剂溶液，备用。
[0012]在一实施例中，所述糖类、所述甘露醇和所述山梨醇分别溶解于PBS缓冲液中，PBS缓冲液的pH值为7.0～7.4。
[0013]在一实施例以中，所述赋形剂、所述增稠剂及所述防腐剂在所述冻干保护液中的重量百分比分别为1％～20％、0.5％～5％及0.01％～0.1％，所述冻干保护液的其余成分包括无菌水和PBS缓冲液。可选地，PBS缓冲液的pH值为7.2，浓度为1mol/L。
[0014]在一实施例中，冻干保存具体实施如下：
[0015]‑
80℃4
‑
10℃预冻至少20min，或液氮速冻至少2min；
[0016]放入冻干机中
‑
50～25℃进行冻干。
[0017]具体地，按照如下步骤冻干：
[0018]预冻
‑
80℃，30min
‑
60min；
[0019]上冻干机，冻干曲线为：
‑
45℃，101.325kPa，5h；
‑
37℃，0
‑
10Pa，6h；
‑
27℃，0
‑
10Pa，3h；
‑
17℃，0
‑
10Pa，3h；
‑
7℃，0
‑
10Pa，3h；3℃，0
‑
10Pa，1h；13℃，0
‑
10Pa，1h，23℃，0
‑
10Pa，2h。
[0020]在一实施例中，该冻干保护方法还包括如下复溶步骤：
[0021]C、在使用时，用缓冲液润洗冻干粉中的筛网以去除筛网表面的冻干粉，在所述筛网的表面孵育抗体，获得能够和生物分子或细胞特异性结合的富集筛网。
[0022]进一步地，使1～2mL的PBS缓冲液流经筛网。
[0023]在一实施例中，步骤A中，冻干保护液的用量为浸没富集筛网且液位至少高于富集筛网1～2mm。
[0024]在一实施例中，筛网骨架包括多个相互交叉的网丝，所述筛网骨架具有由多条相互交叉设置的所述网丝形成的多个筛孔。所述筛孔的孔径为10μm
‑
50μm。进一步地，所述筛孔的孔径为10μm
‑
20μm，适于稀有细胞的捕获。所述网丝为金属丝或塑料丝，包括但不限于不锈钢丝、镀金不锈钢丝、尼龙丝、聚对苯二甲酸乙二醇酯丝等。稀有细胞是指在血液和组织中的含量很少但却很重要的细胞，例如PBMC中的各类免疫细胞、T细胞、CAR
‑
T细胞、循环胎儿细胞、有核红细胞、干细胞、循环肿瘤细胞等。优选地，筛网骨架为不锈钢镀筛网。高分子层的原料包括但不限于：聚乙二醇、透明质酸等。抗体包括EpCAM抗体，该富集筛网用于富集循环肿瘤细胞。
[0025]根据本专利技术的第二个方面，一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护液，包括赋形剂、增稠剂及防腐剂，其中，所述赋形剂包括重量比为4～6∶1～3∶2～3的糖类、甘露醇和山梨醇。
[0026]在一实施例中，所述糖类、所述甘露醇和所述山梨醇的重量比为5～6∶1～2∶3。
[0027]在一实施例中，所述糖类包括选自蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或多种的组合；和/或，所述增稠剂包括聚乙烯吡咯烷酮；和/或，所述防腐剂包括硫柳汞和/或叠氮钠；和/或，所述赋形剂、所述增稠剂及所述防腐剂在所述冻干保护液中的重量
百分比分别为1％～20％、0.5％～5％及0.01％～0.1％，无菌水和PBS缓冲液。可选地，P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法，所述生物分子或细胞富集筛网包括筛网骨架、覆于所述筛网骨架上的高分子层及包被与所述高分子层上的能够目标生物分子活细胞特异性结合的抗体，其特征在于，包括如下步骤：将包被有高分子层的筛网置于冻干保护液中，所述冻干保护液浸没所述筛网，其中，所述冻干保护液包括赋形剂、增稠剂及防腐剂，其中，所述赋形剂包括重量比为4～6∶1～3∶2～3的糖类、甘露醇和山梨醇；冻干保存，使筛网被包裹在由所述冻干保护液形成的冻干粉中。2.根据权利要求1所述的冻干保护方法，其特征在于，所述糖类、甘露醇和山梨醇的重量比为5∶2∶3。3.根据权利要求1所述的冻干保护方法，其特征在于，所述糖类包括选自蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或多种的组合。4.根据权利要求1所述的冻干保护方法，其特征在于，所述增稠剂包括聚乙烯吡咯烷酮；和/或，所述防腐剂包括硫柳汞和/或叠氮钠；和/或，所述赋形剂、所述增稠剂及所述防腐剂在所述冻干保护液中的重量百分比分别为1％～20％、0.5％～5％及0.01％～0.1％，所述冻干保护液的其余成分包括无菌水和PBS缓冲液。5.根据权利要求1所述的冻干保护方法，其特征在于，冻干保存具体实施如下：
‑
80℃
±
10℃预冻至少20min，或液氮速冻至少2min；放入冻干机中
‑
50～25℃进行冻干。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，周岩，
申请(专利权)人：江苏汇先医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：