一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用技术

本发明专利技术公开一种基因工程高产ε

【技术实现步骤摘要】
一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高
ε
‑
聚赖氨酸产量的方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε
‑
聚赖氨酸产量的方法和应用。

技术介绍

[0002]ε
‑
聚赖氨酸(ε
‑
poly
‑
lysine)和γ
‑
聚谷氨酸是目前发现两种天然多聚氨酸。自1977年日本学者发现首株生产ε
‑
聚赖氨酸菌株白色链霉菌(S.albulus)以来，后从土壤中筛选出多株具有生产ε
‑
聚赖氨酸的菌株，其中大部分菌株属于链霉菌属(Streptomyces)和北里孢菌属(Kitasatospora)。ε
‑
聚赖氨酸由25
‑
35个赖氨酸的ε
‑
氨基和α
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羧基通过酰胺键连接而成。因其抑菌图谱广、水溶性好、热稳定性强，目前被广泛应用为食品防腐剂，还可用作化妆品、基因载体、药物包被物等。如：ε
‑
聚赖氨酸为多阳离子聚合物，可与带电质粒利用静电吸附作用而形成基因复合物，可有效避免核酸酶降解；ε
‑
聚赖氨酸和氨甲蝶呤形成复合物，在可以有效治疗白血病和恶性肿瘤的同时，并提高靶细胞对于氨甲蝶呤的吸收。目前于食品、医药、材料等领域均有极大的发展前景。
[0003]由于ε
‑
聚赖氨酸有着优良的品质和良好的市场前景，关于提高ε
‑
聚赖氨酸产量研究一直在开展。早期为提高ε
‑
聚赖氨酸产量多从发酵工艺优化和诱变育种等方面出发。如2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε
‑
聚赖氨酸的产量；1988年日本Chisso公司以S.albulus No.346为出发菌株，经NTG和S
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AEC为抗性筛选标记，获得一株较出发菌株产量提高3.3倍；而国内研究人员如李双双，吴振强等人就曾以白色链霉菌为初始菌株进行紫外和DES复合诱变，成功获得一株突变菌产量达到0.73g/L，比初始菌株提高2.2倍。而基于构建工程菌株提高ε
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聚赖氨酸产量的方法则相对较少，尤其是通过过表达TCA循环关键酶苹果酸脱氢酶(Mdh)的方法未发现相关报道。
[0004]通过检索，发现如下与本专利技术专利申请相关的公开文献：
[0005]1.一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD
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4，它是将来源于S.albulus PD
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1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，较出发菌株有着更高的ε
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聚赖氨酸合成能力。虽然工程菌的ε
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聚赖氨酸合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了对于氮源等菌体生长物质的利用率，并无进一步提高代谢途径强度，因此小白链霉菌ε
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PL产量仍有提升空间。
[0006]2.一株小白链霉菌基因工程菌株及其在ε
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聚赖氨酸生产中的应用(CN111454873A)，公开了一株基因工程菌小白链霉菌(Streptomyces albulus)Q
‑
PL2，它是将源于S.albulus Q
‑
PL的聚赖氨酸合成酶(Pls)基因进行过表达处理，较出发菌株小白链霉菌野生菌Q
‑
PL产量提高2
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5倍，虽然ε
‑
聚赖氨酸的生产能力有所提高，但该工程菌株主要强化单一代谢途径，而非多条代谢通路的提高，ε
‑
PL的生产能力仍然有待提高。
[0007]3.一株链霉菌及其制备ε
‑
聚赖氨酸的方法，(CN 110804572A)公布了一株小白链
霉菌(Streptomyces albulus)GS
‑
114，它是通过对其小白链霉菌(Streptomyces albulus)M
‑
Z18进行3μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL或更高浓度的链霉素、庆大霉素和利福霉素抗性筛选而产生基因重排。较出发菌株S.albulus GS
‑
114的ε
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聚赖氨酸摇瓶产量由1.72
±
0.08g/L提升到2.8
±
0.12g/L，ε
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聚赖氨酸的生产能力有所提高，但基于基因重排手段获得高产菌株存在工作量大，盲目性强的特点。
[0008]4.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε
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聚赖氨酸产量的方(CN 111471633A)公布了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CATF，它是将源于S.diastatochromogenes TUST的述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(catF)进行过表达处理较出发菌株ε
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聚赖氨酸生产能力提高27.91％。表明了该基因对ε
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聚赖氨酸生产能力提高具有重要作用。
[0009]通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

[0010]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε
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聚赖氨酸的生产方法和应用。
[0011]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0012]一种基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。
[0013]一种基因工程高产ε
‑
聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其构建步骤如下：
[0014]⑴
提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP
‑
MDH，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25μg/mL卡那霉素、50μg/mL安普霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD
600
＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
[0015]⑵
向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程高产ε
‑
聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，其特征在于：过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。2.一种基因工程高产ε
‑
聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：其构建步骤如下：
⑴
提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP
‑
MDH，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25μg/mL卡那霉素、50μg/mL安普霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD
600
＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；
⑵
向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomyces diastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2
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3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；
⑶
将步骤
⑴
的阳性转化子大肠杆菌和步骤
⑵
萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl2的SFM培养基上，30℃倒置培养14
‑
18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3
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5天，挑选阳性结合子单克隆，得到基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH。3.根据权利要求2所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤
⑵
中淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。4.根据权利要求2所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤
⑵
中每1LM3G培养基组成为：(NH4)2SO410 g/L，KH2PO41.36 g/L，K2HPO40.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；或者，每1L贝纳特培养基的组成为：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15
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20g，加水补充至1L，NaOH调pH 7.7；或者，所述步骤
⑶
中每1L SFM培养基的组成为：黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4；其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。5.根据权利要求2所述的基因工程高产ε
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭之磊，唐昆鹏，贾士儒，侯颖，周东浩，董天宇，许倍铭，刘洋，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：