一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，步骤如下：S1、提取待测物种的全基因组DNA；S2、利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S3、电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测物种不是香花油茶，如果有目标条带，则进行下一步；S4、对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，鉴别香花油茶物种，并进行系统发育树分析。本发明专利技术采用上述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，达到物种自动鉴定的目的。定的目的。定的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法


[0001]本专利技术涉及生物鉴定
，尤其是涉及一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法。

技术介绍

[0002]花油茶(Camellia osmantha Ye CX,Ma JL et Ye H.)是2012年在广西南宁发现的一种山茶属短柱茶组新种，不仅早熟、果量多、出籽率高，而且属性美观、花带香气，也称为香花油茶。目前，经过几年的研究和积累，已选育出大量香花油茶的优良单株、无性系和家系。
[0003]但是，由于香花油茶的遗传背景较为复杂，目前为止，一直没有有效的分子遗传鉴定系统对香花油茶进行遗传进化分析，使香花油茶分子水平上的研究受到极大限制。为了更大范围地推广香花油茶，目前甚至未来更长时间，需要更加深入了解香花油茶的遗传机理。
[0004]DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准、有足够变异、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。
[0005]在植物中，谱系偏选和杂交现象非常普遍，而山茶属种类繁多，油茶的遗传结构和系统演化关系更为复杂，增加了筛选DNA条形码的难度，这样就更需要从不同的基因组中选择基因来保证鉴定的准确度。
[0006]植物叶绿体基因组(cpDNA)为单亲遗传，其DNA片段容易扩增和测序。叶绿体基因matK、rbcL、trnH
‑
psbA、ycf1等具有进化速率快、大小片段适中、种间差异度高且碱基转换/颠换数低、序列信息数据庞大，引物通用性好、序列扩增率高等特点，因此被广泛用来进行DNA条形码分析，在药用植物、木兰科等植物中已成功应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，达到物种自动鉴定的目的。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，步骤如下：
[0009]S1、提取待测物种的全基因组DNA；
[0010]S2、利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0011]S3、电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测物种不是香花油茶，如果有目标条带，则进行下一步；
[0012]S4、对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，鉴别香花油茶物种，并进行系统发育树分析。
[0013]优选的，DNA条形码引物包括matK引物、rbcL引物或trnH
‑
psbA引物中的一种或多
种。
[0014]优选的，matK的扩增引物为：
[0015]正向引物(SEQ ID NO.1)：5
’‑
TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT
‑3’
；
[0016]反向引物(SEQ ID NO.2)：5
’‑
CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA
‑3’
；
[0017]优选的，rbcL的扩增引物为：
[0018]正向引物(SEQ ID NO.3)：5
’‑
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
‑3’
[0019]反向引物(SEQ ID NO.4)：5
’‑
GTAAAATCAAGTCCACCRCG
‑3’
[0020]优选的，trnH
‑
psbA的扩增引物为：
[0021]正向引物(SEQ ID NO.5)：5
’‑
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
‑3’
[0022]反向引物(SEQ ID NO.6)：5
’‑
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
‑3’
。
[0023]优选的，步骤S2中PCR扩增体系为：10μL 2
×
PCR扩增体系混合液，10μM引物对，30ng的DNA模板，反应体系终体积20μL；
[0024]PCR反应条件为94℃反应3min；然后94℃变性35s，55℃退火30s，72℃延展1min，如此35个循环；最后72℃延展7min。
[0025]一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的试剂盒，所述试剂盒中含有matK引物、rbcL引物或trnH
‑
psbA引物中的一种或多种引物对。
[0026]因此，本专利技术采用上述一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，达到物种自动鉴定的目的。
[0027]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0028]图1是不同引物对PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0029]图2是样品部分目标序列比对结果图；
[0030]图3是基于单序列的系统进化树分析图；
[0031]图4是基于组合序列的系统进化树分析图。
具体实施方式
[0032]以下通过附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0033]除非另外定义，本专利技术使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
[0034]试验测试
[0035](1)材料与方法
[0036]供试材料为12株香花油茶无性系，编号分别为1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1717、1718、1719、、F1、G
‑
8，均种植于广西南宁老虎岭。
[0037]DNA提取：取干燥叶片约1g，液氮研磨5min，使用植物基因组DNA提取试剂盒HP Plant DNAKit(OMEGABio
‑
Tec.)提取总DNA。DNA质量利用琼脂糖凝胶电泳检测，利用NanoDrop 2000检测所提浓度，最后在
‑
20℃冰箱冷冻保存。
[0038](2)PCR体系的建立
[0039]PCR扩增体系为：2μL 10
×
PCR buffer，Mg
2+
1.2μL，dNTPs 0.4μL，10μM正向引物1μ
L，10μM反向引物1μL，Taq聚合酶0.2μL，DNA模板1μL，加H2O至总体积为20μL。
[0040]PCR反应程序：94℃反应3min；然后94℃变性35s，引物对退火温度55℃退火30s，72℃延展1min，35个循环；最后72℃延展7min。
[0041](3)DNA测序和序列分析
[0042]PCR扩增产物经1％琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，其特征在于，步骤如下：S1、提取待测物种的全基因组DNA；S2、利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S3、电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测物种不是香花油茶，如果有目标条带，则进行下一步；S4、对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，鉴别香花油茶物种，并进行系统发育树分析。2.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，其特征在于：DNA条形码引物包括matK引物、rbcL引物或trnH
‑
psbA引物中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，其特征在于，matK的扩增引物为：正向引物5
’‑
TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT
‑3’
；反向引物5
’‑
CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA
‑3’
。4.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法，其特征在于，rbcL的扩增引物为：正向引物5
’‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张照远，郝丙青，叶航，马锦林，孟中磊，陈国臣，王东雪，蔡娅，吴方圆，戴艳花，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：