一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，包括以下步骤：先将原始pTargetF质粒改造为包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter

【技术实现步骤摘要】
一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法


[0001]本专利技术属于生物技术，具体涉及一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法。

技术介绍

[0002]lac操纵子是大肠杆菌组最常见的表达调控单位，可使细胞摄入并代谢β
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半乳糖苷类糖，如乳糖。其中三个代谢基因包括编码β
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半乳糖苷酶（β
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galactosidase）的lacZ基因，编码β
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半乳糖苷通透酶(permease)的lacY基因以及编码β
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半乳糖苷转乙酰基酶(transacetylase)的lacA。此外还包括了表达阻遏物（Lac repressor）的不可调控基因lacI。lac操纵子的转录调控对于诱导物的应答十分迅速，在不含β
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半乳糖苷的条件下，每个细胞约含5个分子β
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半乳糖苷酶，在加入适宜底物时，2
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3min该酶即可表现出活性并且后续很快达到约5000个分子水平，并且β
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半乳糖苷酶的量最高可达总可溶性蛋白的5%
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10%，若除去底物，该酶的合成会立即停止。正是由于此特性，此结构往往被用于质粒改造或基因编辑，并使用不可降解的IPTG作为诱导底物控制目的基因的表达。
[0003]乳糖作为重要生命反应的重要成分，其代谢过程研究得较为清晰，具有成熟的工业生产工艺。目前，乳糖被广泛应用于食品与生化研究，在工业发酵方面具有广泛的应用前景。lac操纵子具备代谢乳糖的能力，如果以乳糖为底物进行生物合成就必须要限制细胞本身的乳糖代谢能力。目前大肠杆菌有lacZΔM15基因突变型限制自身乳糖代谢，此种突变是lacZ基因是通过缺失编码β
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半乳糖苷酶中第11
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41个氨基酸的片段，导致表达产物ω片段不具备酶学活性，如JM109系列、DH5α、TOP10等。该突变可通过携带编码α片段基因的lac操纵子通过载体DNA（如pUC19 DNA）补全得到具备活性的β
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半乳糖苷酶，常用作菌株蓝白斑筛选。
[0004]如果选择以JM109系列等lacZ缺陷型的菌株作为本底菌株，首先会受到菌株选择的限制；其次lacZΔM15基因型的菌株，在诱导后由于启动子高效响应所产生大量缺陷的β
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半乳糖苷酶分子会浪费细胞的许多资源和能量，这对发酵过程中细菌生长及产物收益会产生不利影响；此外lacZΔM15基因型所表达出的缺陷β
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半乳糖苷酶分子仍具有约正常功能3%活性，这就使得细菌自身仍具备代谢少量乳糖的能力，在长时间的发酵过程中会降低底物的转化率。
[0005]大肠杆菌的许多株系均可用于工业生物合成，其中就有无缺陷lac操纵子的菌株如BL21系列等，由于可自身代谢乳糖,必须经过改造后才能使用。这就使它们在作为发酵本底菌株时必须经过比lacZΔM15基因型菌株更多的改造步骤才能发挥菌株效果，无疑增加了研发成本。
[0006]综上所述，以大肠杆菌为本底菌株发酵乳糖，现有技术存在以下缺陷：lacZΔM15基因型菌株在发酵过程中会产生大量有缺陷的β
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半乳糖苷酶分子，会造成细胞代谢的资源浪费，增加细胞负担，同时有缺陷的β
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半乳糖苷酶分子仍具备少量活性，不利于发酵收益；携带有完整lac操纵子的菌株自身具备了乳糖代谢能力，必须经过额外改造才能构建发酵菌株；不同lac操纵子基因型的菌株均存在一定缺陷，没有一个通用的改造方法同时适用于
不同的大肠杆菌，这会造成在构建发酵菌株时消耗额外的研发成本，限制菌株选择。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于使用一种简单高效的方法，克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷，同时适用任意lac操纵子的大肠杆菌改造，增加本底菌株的可选项，节省构建菌株时的成本。
[0008]本专利技术采用如下技术方案：一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，包括以下步骤：在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列以及包含lacY调控序列的重组同源模板，得到pTargetT质粒；之后将已经转入pCas质粒的本底菌株使用阿拉伯糖诱导，再转入pTargetT质粒，经过培养鉴定后消除pCas与pTargetT，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。上述方法具体为，先将原始pTargetF质粒改造为具备包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter
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N20
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gRNA scaffold结构质粒，同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列，得到大肠杆菌基因组编辑质粒pTargetT；在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后，使用阿拉伯糖诱导表达λ
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Red重组酶，随后转入pTargetT编辑质粒，培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。
[0009]本专利技术中，质粒模板为pTargetF质粒，将原本的pTargetF质粒sgRNA前面的碱基序列替换成所需要的PAM序列（NGG）前20个碱基序列（敲除序列的N20序列），本专利技术中，通过Gibson Assembly Master Mix试剂进行连接与插入。
[0010]本专利技术中，用于调控lacY表达水平的短片段可以选择为BBa_B0034（tctagagaaagaggagaaatactag）、BBa_B0030（tctagagattaaagaggagaaatactag）、BBa_B0032（tctagagtcacacaggaaagtactag）、BBa_J61101（tctagagaaagacaggacccactag）或其它RBS。在原核细胞调控基因表达的各种元件中，核糖体结合位点（RBS，ribosomebinding site）是影响基因表达水平的重要序列，可参考iGEM。
[0011]具体的，上述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法步骤如下：（1）设计待敲除序列的前N20序列、后N20序列，并设计包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对；再利用包含前N20序列的引物对扩增质粒模板得到包含前N20序列的质粒，利用包含后N20序列的引物对扩增质粒模板得到包含后N20序列的质粒；（2）所述包含前N20序列的质粒经过扩增得到线性质粒；所述包含后N20序列的质粒经过扩增得到片段；（3）以本底菌株的基因组为模板，分别利用HDL引物对、HDR引物对进行扩增，分别得到HDL扩增产物、HDR扩增产物；（4）连接步骤（2）的线性质粒、片段、步骤（3）的HDL扩增产物、HDR扩增产物，然后转化感受态细胞，挑出阳性单克隆为编辑质粒；（5）将pCas质粒转入本底菌株感受态细胞，抗性板培养后挑选单克隆，于卡那霉素抗性LB中培养后1:100转接，使用阿拉伯糖诱导培养，随后制备电转感受态细胞并导入编辑质粒；培养后挑选单克隆，消除引入的质粒，完成发酵乳糖的大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，其特征在于，包括以下步骤：在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列以及包含lacY调控序列的重组同源模板，得到pTargetT质粒；之后将已经转入pCas质粒的本底菌株使用阿拉伯糖诱导，再转入pTargetT质粒，经过培养鉴定后消除pCas与pTargetT，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。2.根据权利要求1所述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，其特征在于，设计待敲除序列的前N20序列、后N20序列，并设计包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对；再利用包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列。3.根据权利要求1所述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，其特征在于，所述调控lacY表达水平的短片段为BBa_B0030、BBa_B0032、BBa_B0034、BBa_J61101或其它RBS中的一种。4.根据权利要求1所述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，其特征在于，本底菌株为改造的大肠杆菌菌株，也可以为未改造的大肠杆菌菌株。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，郭涛，
申请(专利权)人：黄山同兮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：