一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于：（1）将糖基转移酶UGT76G1和UGT11基因连到PBR322质粒载体上，导到枯草芽孢杆菌中，接入LB培养基，30～37℃、100

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法


[0001]本专利技术属微生物发酵酶制剂
，涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法。

技术介绍

[0002]甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，能量约为蔗糖的1/300，无毒无副作用，具有较高的稳定性和安全性，是代替蔗糖理想的天然甜味剂，被国际上誉为“第三糖源”。有研究报道，长期食用甜菊糖可以预防高血压、糖尿病、肥胖病、蛀齿等疾病。甜菊苷占糖苷总量的60% ～ 70%，其口感差于莱鲍迪苷M，有一定的后苦味。莱鲍迪苷M是甜菊糖苷混合物中的一种糖苷成分，是甜菊糖苷成分中甜度最高的，口感最接近蔗糖，具有更高的稳定性。
[0003]目前，有报道利用酶法和发酵法对甜菊糖进行改质，可以将甜菊苷催化为莱鲍迪苷M，可以大大改善甜菊糖原料的口感，减弱后苦味。这些方法大多成本高、工艺复杂，难以工业化生产。因此，有必要发展一种工艺简单，成本低、能应用于工业化生产莱鲍迪苷M的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有酶法和发酵法将甜菊苷催化为莱鲍迪苷M的生产中存在的生产成本高，操作复杂，不能应用于工业化生产的问题，提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因连接到PBR322质粒载体上，将载有糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30～37℃，转速100
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250 rpm，培养20～24 h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为200～400 rpm，通气比为0.1～1 V/V.min，30～37℃温度下培养20～24 h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为200～1000 rpm，通气比为0.1～2 V/V.min，在30～37℃温度下，控制pH为6～8，培养48～72小时，发酵结束得到发酵液；（4）将步骤（3）所得的发酵液采用陶瓷膜超滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到枯草芽孢杆菌
菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用陶瓷膜超滤的方法得到粗酶液，其中陶瓷膜过滤的孔径小，微米级别，过滤的菌泥更干净彻底；（5）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5
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10：1
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5：40
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60 ：5
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20 混合，随后在25
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40℃下反应12
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48 h即可得莱鲍迪苷M。
[0006]进一步，所述步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照豆饼粉10
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40 g、麸皮20
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50 g、玉米粉30
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60 g、磷酸氢二铵1
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10 g、磷酸氢二钠1
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10 g、氯化钙0.1
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5 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6～8，用去离子水定容至1000 ml。
[0007]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1.本专利技术所述制备莱鲍迪苷M的方法，通过一次发酵获得两种粗酶液，减少了操作步骤，降低了生产的成本，易于工业化生产，解决了目前发酵法酶活低，操作复杂，生产成本高的问题；2.本专利技术中宿主菌为枯草芽孢杆菌，食品安全性能高；3.发酵培养基中所用的豆饼粉、麸皮、玉米粉等均为廉价、来源广泛的原料，大幅度的降低了生产的成本。
[0008]4.本专利技术中催化莱鲍迪苷M的方法，酶活水平较高（26944.9
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29537.7 U/ml），转化率在88.4%以上，远高于现有报道产量，降低了生产成本，更有利于工业化生产。
具体实施方式
[0009]一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，具体实施步骤如下：实施例1（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因连接到PBR322质粒载体上，将载有糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度35℃，转速200 rpm，培养时间20 h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照5%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为300 rpm，通气比（通气比为每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比）为0.5 V/V.min，35℃温度下培养20 h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照5%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中所述发酵培养基，按照豆饼粉20 g、麸皮28 g、玉米粉40 g、磷酸氢二铵5 g、磷酸氢二钠5 g、氯化钙2 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为7，用去离子水定容至1000 ml；控制发酵罐转速为500 rpm，通气比为1 V/V.min，在30℃温度下，控制pH为7.5，培养60小时，发酵结束得到发酵液；（4）将步骤（3）所得的发酵液采用陶瓷膜超滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬10min，高压（0.3Mp）均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用陶瓷膜超滤的方法得到粗酶液；（5）催化体系：1000 L反应体系，甜菊糖苷50 kg，尿苷二磷酸葡萄糖1.2 kg，磷酸缓冲液600 kg，粗酶液60 kg，剩下加水补充到1000 L进行混合，在30℃下反应时间30 h即可得莱鲍迪苷M。
[0010]实验测得粗酶液的酶活水平为26944.9 U/ml，催化甜菊糖苷到莱鲍迪苷M的转化率为88.4%。
[0011]实施例2（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因连接到PBR322质粒载体上，将载有糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30℃，转速220 rpm，培养时间24 h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因连接到PBR322质粒载体上，将载有糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因和糖基转移酶UGT11基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30～37℃，转速100
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250 rpm，培养20～24 h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为200～400 rpm，通气比为0.1～1 V/V.min，30～37℃温度下培养20～24 h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为200～1000 rpm，通气比为0.1～2 V/V.min，在30～37℃温度下，控制pH为6～8，培养48～72小时，发酵结束得到发酵液；（4）将步骤（3）所得的发酵液采用陶瓷膜超滤的方法得到枯草芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨乐，张敏，祁飞，戴永辉，
申请(专利权)人：安徽金禾实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：