一种几丁质脱乙酰酶CDA-1基因的重组表达载体及其制备方法、重组菌及应用技术

本发明专利技术公开了一种几丁质脱乙酰酶CDA

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体及其制备方法、重组菌及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体及其制备方法、重组菌及应用。

技术介绍

[0002]氨基葡萄糖(GlcN)又称葡萄糖胺，是一种重要的氨基糖，是合成氨基聚糖的基本物质和糖蛋白的主要组成成分。在机体内具有重要的生理意义，能够特异性作用于关节软骨恢复软骨细胞代谢，达到治疗骨关节炎的效果，GlcN还具有治疗颈椎病、缓解早期股骨头缺血性坏死、抑制白血病、抗癌、消炎护肝等作用。因此在食品，医药领域中具有广泛应用。
[0003]甲壳素经强酸水解获得GlcN是工业中生产GlcN的主要方式。但是传统的生产工艺不仅需要消耗大量的酸碱，腐蚀设备，造成环境的污染，且产率低，产物不纯，产物是氨基葡萄糖盐酸盐而非氨基葡萄糖单体。这些在某种程度上限制了GlcN的广泛应用。目前已有多篇报道用微生物发酵法生产GlcNAc，如枯草芽孢杆菌及大肠杆菌发酵生产GlcNAc。在该方法中，微生物代谢合成的GlcNAc需采用酸水解法生成GlcN，存在与化学法同样的缺点，且产率低，需要投入大量资金用于工程菌研究，难用于生产实践和工业化大规模生产。现阶段市售的脱乙酰酶多是针对GlcNAc的寡聚体形式进行作用，而特异性作用于GlcNAc单体的脱乙酰酶鲜有报道。前期研究成果发掘的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase，CDA)CDA
‑
1是一种专一性作用于GlcNAc单体生成GlcN的酶。该方法获得的GlcN不仅绿色环保，而且产物是氨基葡萄糖单体而非氨基葡萄糖盐酸盐。利用生物信息学与基因工程技术获得了重组CDA
‑
1工程菌，并能通过异源表达获得可溶性蛋白，且转化率达到百分之百，具有实现大规模生产GlcN的优势。重组蛋白的表达量受基因自身性质、表达载体、宿主菌以及培养条件等多种因素的影响。为了进一步达到GlcN的工业化生产水平，有必要获得表达量更高活性更强的重组CDA
‑
1。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体及其制备方法、重组菌及应用，通过构建不同表达载体提高目标蛋白的表达量。利用重组菌生产几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1的方法操作简单，易于控制，反应条件温和，对设备要求较低。相较于酸水解法生产GlcN，生物催化法操作简单，成本低，污染小，对反应对底物的专一性高，产物纯度高。通过提高工具酶产量从而提高GlcN产率，有利于大规模的工业化应用。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体，所述几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组表达载体为pET28a
‑
CDA
‑
1、pET30a
‑
CDA
‑
1、MBP
‑
pET30a
‑
CDA
‑
1和pET41b
‑
CDA
‑
1，所述重组表达载体源始于pET28a
‑
CDA
‑
1。
[0007]一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体的制备方法：
[0008](1)所述pET28a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：
[0009]根据pET28a载体的结构设计引物，引物两端带有限制性内切酶BamHI和XhoI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：
[0010]上游引物28a
‑
F如SEQ ID NO.3所示；
[0011]下游引物28a
‑
R如SEQ ID NO.4所示；
[0012]采用BamHI和XhoI双酶切将带有目标基因的模板质粒与pET28a质粒酶切为线性状态，再通过连接获得pET28a
‑
CDA
‑
1；
[0013](2)所述pET30a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：
[0014]根据pET30a载体的结构设计引物，引物两端带有限制性内切酶EcoRI和XhoI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：
[0015]上游引物30a
‑
F如SEQ ID NO.5所示；
[0016]下游引物30a
‑
R如SEQ ID NO.6所示；
[0017]采用EcoRI和XhoI双酶切将带有目标基因的模板质粒与pET30a质粒酶切为线性状态，再通过连接获得pET30a
‑
CDA
‑
1；
[0018](3)所述MBP
‑
pET30a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：
[0019]根据如SEQ ID NO.2所示MBP麦芽糖结合蛋白标签的基因序列设计引物，引物两端带有限制性内切酶NdeI和KpnI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：
[0020]上游引物MBP
‑
F如SEQ ID NO.7所示；
[0021]下游引物MBP
‑
R如SEQ ID NO.8所示；
[0022]通过改造pET30a质粒，将MBP麦芽糖结合蛋白标签插入到pET30a，得到同时带有His组氨酸标签和MBP标签的载体MBP
‑
pET30a，再利用KpnI和XhoI双酶切将目标基因插入到MBP
‑
pET30a质粒获得MBP
‑
pET30a
‑
CDA
‑
1；
[0023](4)所述pET41b
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：
[0024]根据pET41b载体的结构设计引物，引物两端带有限制性内切酶BamHI和XhoI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：
[0025]上游引物41b
‑
F如SEQ ID NO.9所示；
[0026]下游引物41b
‑
R如SEQ ID NO.10所示；
[0027]采用BamHI和XhoI双酶切将带有目标基因的模板质粒与pET41b质粒酶切为线性状态，再通过连接获得pET41b
‑
CDA
‑
1。
[0028]一种包含上述的重组表达载体的重组表达工程菌株。
[0029]优选地，所述重组表达工程菌株源始于大肠杆菌BL21(DE3)plysS。
[0030]上述的重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体，其特征在于，所述几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组表达载体为pET28a
‑
CDA
‑
1、pET30a
‑
CDA
‑
1、MBP
‑
pET30a
‑
CDA
‑
1和pET41b
‑
CDA
‑
1，所述重组表达载体源始于pET28a
‑
CDA
‑
1。2.权利要求1所述的一种几丁质脱乙酰酶CDA
‑
1基因的重组表达载体的制备方法，其特征在于，(1)所述pET28a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：根据pET28a载体的结构设计引物，引物两端带有限制性内切酶BamHI和XhoI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：上游引物28a
‑
F如SEQ ID NO.3所示；下游引物28a
‑
R如SEQ ID NO.4所示；采用BamHI和XhoI双酶切将带有目标基因的模板质粒与pET28a质粒酶切为线性状态，再通过连接获得pET28a
‑
CDA
‑
1；(2)所述pET30a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：根据pET30a载体的结构设计引物，引物两端带有限制性内切酶EcoRI和XhoI碱基序列以及保护性碱基，引物序列分别为：上游引物30a
‑
F如SEQ ID NO.5所示；下游引物30a
‑
R如SEQ ID NO.6所示；采用EcoRI和XhoI双酶切将带有目标基因的模板质粒与pET30a质粒酶切为线性状态，再通过连接获得pET30a
‑
CDA
‑
1；(3)所述MBP
‑
pET30a
‑
CDA
‑
1的制备方法如下：根据如SEQ ID NO.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕永梅，章晓洋，余晓红，王冕，张译文，柳晓晨，商曰玲，刘金彬，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：