一种单克隆抗体组合物提纯方法技术

本申请涉及生物制药领域，具体涉及一种单克隆抗体组合物提纯方法，包括如下步骤：S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理，除去组合物中的脂类物质，得到中间物；S2、通过硫酸铵两步法或辛酸

【技术实现步骤摘要】
一种单克隆抗体组合物提纯方法


[0001]本申请涉及生物制药领域，更具体地说，它涉及一种单克隆抗体组合物提纯方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体自研发以来，在生物制药、生物检测等相关领域具有重大的运用。单克隆抗体的制备方法一般如下：通过抗原对小鼠进行免疫，免疫后取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞中阳性较高的杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，经过多次筛选后，得到阳性水平最高的杂交瘤细胞，再将其种植于小鼠腹腔内，最后对腹水进行分离纯化，得到单克隆抗体。
[0003]腹水分离方法目前种类较多，常用的有硫酸铵两步法或辛酸
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硫酸铵，其原理在于通过抗体和杂质蛋白的等电点不同，控制硫酸铵的浓度或体系的pH使不同的组分分别析出，进而实现分离。这两种方法操作简单，物料来源较为便宜，适用于工业化生产，在单克隆抗体最大产能只有公斤级的今天，对上述方法进行进一步研究具有重要的意义。但是腹水中除了杂质蛋白以外，还有部分脂类物质，该类物质与抗体之间分离较为困难，有时也会干扰杂质蛋白和抗体的分离。

技术实现思路

[0004]为了减少腹水中的脂质成分对抗体分离的影响，本申请提供一种单克隆抗体组合物提纯方法。
[0005]本申请中提供的单克隆抗体组合物提纯方法具体采用如下技术方案：一种单克隆抗体组合物提纯方法，包括如下步骤：S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理，除去组合物中的脂类物质，得到中间物；S2、通过硫酸铵两步法或辛酸
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硫酸铵两步法中的任意一种对中间物进行进一步分离，得到单克隆抗体；其中，单克隆抗体组合物中包括水、脂肪、杂质蛋白和单克隆抗体。
[0006]抗体组合物可以是经过培养的小鼠腹水，也可以是其他含有脂质、杂质蛋白甚至细胞外泌体和囊泡的混合组分，其成分较为复杂。通过介孔二氧化硅进行处理，可以有效地除去抗体组合物中的脂质，进而提高后续的纯化效果。
[0007]介孔二氧化硅的表面具有较多介孔结构，介孔的结构一般具有2～50nm的孔径，在该尺寸下，对于抗体的吸附能力较弱，而对脂质成分的吸附能力较强，其可以在有效除去脂质成分的情况下，对抗体没有明显影响，因此在实际生产中具有广阔的运用前景。
[0008]可选的，所述介孔二氧化硅微球为空心介孔二氧化硅，平均粒径为50～100nm。
[0009]空心介孔二氧化硅具有更好的吸附性，由于二氧化硅具有中性的电荷结构，因此其更加不容易吸附抗体组分，对抗体提纯效果较好且损失较少。
[0010]可选的，步骤S1具体如下：将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合，混
合时间为5～10min，温度为20～37℃，随后通过离心将吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球进行分离。
[0011]选用上述参数整体具有较好的吸附性和较少的抗体损失，属于优化的参数。
[0012]可选的，所述介孔二氧化硅微球中包覆有顺磁核结构。
[0013]采用了顺磁核核介孔二氧化硅壳形成的核壳结构介孔二氧化硅颗粒，其在吸附体系中的脂质后，可以通过磁吸附的方式进行分离，分离较为方便，且分离过程中抗体的损失较少。顺磁核可以为四氧化三铁纳米颗粒，也可以是可选的，顺磁核的平均直径为50～100nm。
[0014]在5～40nm粒径范围内的顺磁颗粒在包覆后，整体具有较好的稳定性，且介孔层的尺寸可以较好地吸附脂质，不易脱附，分离也较为容易。
[0015]可选的，在步骤S1中，先将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合，混合时间为15～30min，混合温度为20～37℃，随后通过磁吸分离吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球。
[0016]在上述技术方案中，可以充分地对脂质进行吸附，有助于更好地对单克隆抗体组合物进行提纯。
[0017]可选的，在步骤S1中，将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体混合后，进行震荡处理，震荡频率100～200转/分，震荡幅度10～20mm。
[0018]通过震荡，有助于减少抗体在介孔二氧化硅微球表面的吸附，震荡过程中，由于发生了更加充分的接触，因此更容易发生热力学平衡状态，而在热力学平衡状态中，脂质的吸附具有更高的优先级，因此有助于进一步减少抗体的损失。
[0019]可选的，在步骤S1中，加入非离子表面活性剂，非离子表面活性剂的质量为介孔二氧化硅微球质量的0.5～1倍。
[0020]在上述技术方案中，通过加入非离子表面活性剂，可以提高介孔二氧化硅微球在体系中的分散性，且对于后续的抗体沉降没有明显的影响。
[0021]可选的，在步骤S1中，还加入柠檬酸，柠檬酸的加入质量为介孔二氧化硅微球质量的0.02～0.1倍。
[0022]柠檬酸的加入一方面提供一定的抗氧化性，减少单克隆抗体在提纯过程中的损失，同时，少量的柠檬酸的加入并不会对后续分离产生不良影响。另外，柠檬酸可以进一步提高介孔二氧化硅微球对脂质的吸附性能，提高分离效果。
[0023]可选的，在步骤S1中，加入缓冲溶液，并控制pH值为6.8～7.4，缓冲溶液的加入后，控制步骤S1中，介孔二氧化硅微球的质量浓度为2～10mg/mL。
[0024]在上述技术方案中，通过缓冲溶液调整整体pH值，一方面可以提高分离过程中体系的稳定性，另一方面控制pH值后，有助于减少抗体的析出，减少抗体因吸附或团聚造成的损失。
[0025]综上所述，本申请至少包括如下一种有益效果：1、在本申请中，通过添加介孔二氧化硅微球，利用介孔二氧化硅微球对脂质的吸附能力，分离单克隆抗体组合物中的脂质，进而提高单克隆抗体分离后的纯度，适用于单克隆抗体的工业化生产。
[0026]2、在本申请进一步设置中，选用空心介孔二氧化硅，对脂质的吸附性能较好，分离
较为彻底，后续残留脂质较少，所需的处理时间较少。
[0027]3、在本申请的另一种方案中，选用核壳结构的介孔二氧化硅，以顺磁材料为核，进而可以实现磁吸附分离，分离较为方便。
[0028]4、在本申请中，可以添加非离子表面活性剂和柠檬酸，进一步提高分离效果。
具体实施方式
[0029]以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
[0030]在以下实施例和对比例中，部分原料的来源如表1所示。表1、部分物料资料表表1、部分物料资料表
[0031]在以下实施例中，所用的单克隆抗体通过如下步骤进行制备。
[0032]1、对小鼠进行免疫反应。
[0033]将CA125抗原(1mg/mL)与弗氏完全佐剂(见表1)按1：1的体积通过注射器混匀，并乳化完全，选择6
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8周龄的BALB/c雌鼠进行首次皮下免疫，免疫4只小鼠，每只小鼠注射100ul乳化后的抗原。再次免疫用CA125抗原(1mg/mL)与弗氏不完全佐剂按1：1的体积通过注射器混匀，并乳化完全免疫小鼠，每隔15天免疫一次，皮下和腹腔交替进行，免疫3次后，加强免疫，在第3天进行细胞融合。
[0034]2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体组合物提纯方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理，除去组合物中的脂类物质，得到中间物；S2、通过硫酸铵两步法或辛酸
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硫酸铵两步法中的任意一种对中间物进行进一步分离，得到单克隆抗体；其中，单克隆抗体组合物中包括水、脂肪、杂质蛋白和单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅微球为空心介孔二氧化硅，平均粒径为50～100nm。3.根据权利要求2所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法，其特征在于，步骤S1具体如下：将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合，混合时间为5～10min，温度为20～37℃，随后通过离心将吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球进行分离。4.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅微球中包覆有顺磁核结构。5.根据权利要求4所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法，其特征在于，顺磁核的平均直径为50～100nm。6.根据权利要求4所述的一种单克隆抗体组合物提...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈文婷，郑曙剑，
申请(专利权)人：杭州隆基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：