本发明专利技术属于细胞冻存技术领域，公开了一种杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用。本发明专利技术杂交瘤细胞冻存液包含DMEM/F12培养基、二甲基亚砜、牛血清白蛋白)、谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1和表皮细胞生长因子。本发明专利技术杂交瘤细胞冻存液不含血清，化学成分明确，安全性高，解决了传统血清引入未知病原菌带来的潜在风险，所用添加剂成本低来源广，适用于杂交瘤细胞的冻存。用本发明专利技术冻存液保存的杂交瘤细胞，细胞复苏后存活率在85％以上，且细胞活性和功能不发生变化。细胞活性和功能不发生变化。细胞活性和功能不发生变化。
【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用
[0001]本专利技术属于细胞培养和保存
，具体涉及一种杂交瘤细胞冻存液及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]细胞冻存，即使用现有的程序降温技术在
‑
196℃的液氮中冷冻保存细胞，可使细胞暂时停止生长，并保留原有的细胞特性。此外，适度冻存一定数量的细胞可作为细胞种子使用，当细胞因操作或等其他原因发生污染，可使用冻存的细胞顺利的进行后续实验。
[0003]在进行细胞冻存的过程中需要加入适量的细胞冻存液，冻存液中的保护剂可减少冷冻过程中冰晶的形成降低细胞的损伤。同时，冻存液中含有细胞代谢所需的多种营养物质，能维持细胞的正常形态和生理功能。
[0004]传统的细胞冻存液使用90％胎牛血清(非渗透性保护剂)和10％DMSO(渗透性保护剂)混合配制而成，使用这种配制方式均需要添加大量的血清。一方面，血清的纯化方式和产品批次不易控制，成本较高。另一方面，动物来源的血清包含氨基酸，维生素，微量元素，无机盐离子和激素等成分复杂，还有许多未知的成分未被鉴定出来易造成潜在的危险(这是血清使用过程中的缺点，已被科研工作者所熟知)。因此，单克隆抗体的生产中，杂交瘤细胞的培养大多使用无血清培养基，基于此无血清且化学成分明确的冻存液越来越受研发人员的青睐。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：针对当前杂交瘤细胞冻存的技术问题，本专利技术提供了一种无血清、成分明确、效果好的杂交瘤细胞冻存液，本专利技术还提供了该冻存液的制备方法和应用。
[0006]技术方案：为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术的杂交瘤细胞冻存液，包括无血清培养基、冻存保护剂、牛血清白蛋白(BSA)，还包括选自谷氨酰胺(L
‑
Gln)、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、表皮细胞生长因子(EGF)中的一种或多种添加剂。
[0008]在一些技术方案中，所述无血清培养基包括但不限于RPMI
‑
1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基，或以上培养基和F12培养基组成的组合中的一种或多种。
[0009]在一些技术方案中，所述无血清培养基选自DMEM/F12培养基、DMEM、MEM中的一种或多种。
[0010]在一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂，包括但不限于DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、氨基酸或其组合，用于在细胞复苏时，促进细胞外水分进入胞内，以缓解渗透性肿胀引起的损伤。
[0011]在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为非渗透性保护剂，包括但不限于蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白或其组合。非渗透性保护剂可以通过稀释降低胞外电解质的浓度，
减少溶质损伤；还可以通过结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。
[0012]在另一些技术方案中，所述冻存保护剂为渗透性保护剂和非渗透性保护剂的组合。
[0013]在一些技术方案中，所述冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)。
[0014]在一些技术方案中，所述杂交瘤细胞冻存液，包括以下体积百分含量的各个组分：DMEM/F12培养基60.0％
‑
90.0％，优选70％
‑
85％，更优选72.5
‑
82.5％；二甲基亚砜(DMSO)3.0
‑
10.5％，优选4.0
‑
9.0％，更优选5.0
‑
8.0％；牛血清白蛋白(BSA)6
‑
35％，优选8
‑
25％，更优选10
‑
20％；所述冻存液还包括选自谷氨酰胺(L
‑
Gln)、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、表皮细胞生长因子(EGF)中的一种或多种的添加剂。
[0015]在一些技术方案中，所述杂交瘤细胞冻存液，包括以下体积百分含量的各个组分：DMEM/F12培养基72.5
‑
82.5％、二甲基亚砜(DMSO)7.5％、牛血清白蛋白(BSA)10
‑
20％；所述冻存液还包括添加剂谷氨酰胺(L
‑
Gln)、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)和表皮细胞生长因子(EGF)。
[0016]在一些技术方案中，所述谷氨酰胺(L
‑
Gln)在冻存液中的浓度选自3
‑
10mM，优选4
‑
8mM，更优选4.0mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM。
[0017]在一些技术方案中，所述维生素C在冻存液中的浓度选自30
‑
80mg/L，优选40
‑
60mg/L，更优选40mg/L、45.0mg/L、50.0mg/L、55.0mg/L、60.0mg/L。
[0018]在一些技术方案中，所述维生素E在冻存液中的浓度选自20
‑
100mg/L，优选40
‑
80mg/L，更优选40mg/L、45.0mg/L、50.0mg/L、55.0mg/L、60.0mg/L、65.0mg/L、70.0mg/L、75.0mg/L、80.0mg/L。
[0019]在一些技术方案中，所述胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)在冻存液中的浓度选自40
‑
110ng/mL，优选50
‑
100ng/mL，更优选50.0mg/L、55.0mg/L、60.0mg/L、65.0mg/L、70.0mg/L、75.0mg/L、80.0mg/L、85.0mg/L、90.0mg/L、95.0mg/L、100.0mg/L。
[0020]在一些技术方案中，所述表皮细胞生长因子(EGF)在冻存液中的浓度选自20
‑
110ng/mL，优选25
‑
100ng/mL，更优选25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L。
[0021]本专利技术还公开了所述杂交瘤细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
[0022](1)取配方量的DMEM/F12培养基和二甲基亚砜DMSO制成混合液A，涡旋混合均匀，冷藏避光备用；
[0023](2)取混合液A，加入配方量的牛血清白蛋白(BSA)、维生素C、维生素E、谷氨酰胺(L
‑
Gln)、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)和表皮细胞生长因子(EGF)，制成混合液B，涡旋混合均匀，确保添加剂完全溶解；
[0024](3)混合液B无菌过滤。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，包括无血清培养基、冻存保护剂、牛血清白蛋白，还包括选自谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1、表皮细胞生长因子中的一种或多种添加剂。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述无血清培养基选自DMEM/F12培养基、DMEM、MEM中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述冻存保护剂为二甲基亚砜。4.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，包括以下体积百分含量的各个组分：DMEM/F12培养基60.0％
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90.0％，优选70％
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85％，更优选72.5
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82.5％；二甲基亚砜3.0
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10.5％，优选4.0
‑
9.0％，更优选5.0
‑
8.0％；牛血清白蛋白6
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35％，优选8
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25％，更优选10
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20％；所述冻存液还包括选自谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1、表皮细胞生长因子中的一种或多种的添加剂。5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，包括以下体积百分含量的各个组分：DMEM/F12培养基72.5
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82.5％、二甲基亚砜7.5％、牛血清白蛋白10
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20％；所述冻存液还包括添加剂谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胰岛素样生长因子1和表皮细胞生长因子。6.根据权利要求4或5所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述谷氨酰胺在冻存液中的浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，冯速，张晓颖，陈宏洋，陈超，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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