本发明专利技术公布了一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法，所述SSR分子引物组包括26对南荻SSR引物，所述26对南荻SSR引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID No.1～SEQ ID No.52所示。本发明专利技术设计了能够适用于芒属植物南荻的SSR分子标记引物对，能够对不同来源地的南荻材料进行多态性分析，丰富了分析南荻遗传多样性的SSR引物。同时提供了一种评估南荻遗传多样性的方法，提高了评估程序效率，缩短了实验时间，增加评估准确性。确性。确性。
【技术实现步骤摘要】
一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法
[0001]本申请涉及分子生物学
，具体是一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组和方法。
技术介绍
[0002]南荻隶属于禾本科、芒属，是一类多年生的草本植物，也是中国特有的芒属植物种类，主要分布在河流滩涂地带。南荻生物质产量高、光合效率强、纤维质优、高产，能制成高级文具用纸及静电复印纸，具有较佳的经济和生态价值，也是具有开发潜能价值的能源植物。
[0003]DNA分子标记是根据生物个体间基因组DNA序列丰富的变异为基础的遗传标记，可以直接反映生物个体在DNA水平上的遗传多态性，也是继形态学标记、细胞学标记和生化标记之后的最为可靠的遗传标记技术。现有技术中使用的RAPD、AFLP、ISSR标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示南荻遗传多样性真实水平。
[0004]现有技术中评估南荻遗传多样性的方法，实验花费时间长，评估误差大。
技术实现思路
[0005]本专利技术主要针对以上问题，提出了一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组，旨在丰富分析南荻遗传多样性的SSR引物；
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种评估南荻遗传多样性的方法，旨在提高评估程序效率，缩短实验时间，增加评估准确性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组，所述SSR分子引物组包括26对南荻SSR引物，所述26对南荻SSR引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID No.1～SEQ ID No.52所示。
[0008]一种用于评估南荻遗传多样性的方法，包括以下步骤：
[0009]1)提取不同地域南荻的DNA样本；
[0010]2)以所述步骤1)中提取的南荻待测样品DNA为模板，对权利要求1所述26对SSR引物PCR扩增，得到扩增产物；
[0011]3)将所述步骤2)得到的PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，读取电泳数据，统计条带检测结果；
[0012]4)根据所述步骤3)中条带检测结果，建立二元原始数据矩阵；
[0013]5)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用PopGen V1.32软件计算每个位点的等位基因数、每个位点的有效等位基因数、Shannon信息指数、多态性条带数、Nei's相似系数、多态性条带百分率遗传多样性参数；
[0014]6)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用MS
‑
tools软件计算每个引物的多态信息量和Shannon
‑
Weaver多样性指数；
[0015]7)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用软件NTSYSpc 2.10e对不同地域
的南荻计算遗传相似系数；
[0016]8)根据所述步骤7)中的遗传相似系数，利用SAHN Clustering和非加权法平均聚类法做聚类分析，构建聚类树状图。
[0017]进一步地，所述建立二元原始数据矩阵的方法为：将所述步骤3)中的条带检测结果进行比对、校正，利用表格工具在相同迁移率位置上无条带出现记为“0”，有扩增条带出现记为“1”。
[0018]进一步地，所述步骤2)中PCR扩増体系如下：2μl浓度为10pmol/L的模板DNA、6μl2
×
TSINGKE Master Mix、0.24μl浓度为10pmol/L上游引物、0.24μl浓度为10pmol/L下游引物、12μl无菌水。
[0019]进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5min，94℃变性30s，50～68℃退火30s，72℃复性1min，70℃延伸5min；其中，变性、退火和复性循环30次，PCR产物4℃保存。
[0020]进一步地，所述步骤1)中南荻的样本为南荻幼嫩叶片。
[0021]进一步地，所述步骤1)中提取南荻DNA样本方法包括以下步骤：
[0022]a)取0.3g叶脉去除的南荻幼嫩叶片，剪碎后置于无菌1.5ml第一离心管中；
[0023]b)将所述第一离心管浸泡在液氮中速冻10s，向所述第一离心管内灌入1ml液氮，使用预冷冻的镊子将速冻后的所述第一离心管从液氮中取出；
[0024]c)将装备在电钻夹头上的塑料研磨棒伸入1.5ml所述第一离心管内，将南荻幼嫩叶片打碎；
[0025]d)向所述第一离心管中迅速加入1ml 2
×
CTAB提取液，水浴40～50min，涡旋混匀，再于12000rpm，离心10min；
[0026]e)将获取的上清液转至另一无菌的1.5ml第二离心管中；再加入与所述上清液等体积的24：1(V/V)氯仿－异戊醇，颠倒混匀，室温静置5min；
[0027]f)将所述第二离心管12000rpm离心10min后将所述上清液转移至另一无菌的1.5ml第三离心管中；
[0028]g)向所述第三离心管内加入与所述上清液等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，直至白色絮状物出现，再将所述第三离心管放入
‑
20℃冰箱静置，冷冻10min；
[0029]h)将所述第三离心管5000rpm离心5min，弃上清液，得沉淀；
[0030]i)取1ml的70％乙醇溶液洗涤所述沉淀2次，每次3min，后将所述沉淀风干，加入PH为8.0的100～200μL的TE溶液后，在4℃环境置12小时，得到基因组DNA。
[0031]进一步地，所述步骤3)中PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色包括以下步骤：
[0032]Ⅰ)PCR扩增产物用8～15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1
×
TBE，180V恒压电泳90min；
[0033]Ⅱ)将步骤Ⅰ)中电泳完的凝胶剥离出来，置于塑料盒中，在所述塑料盒中加入200ml自来水漂洗5s，共漂洗4次，直至所述塑料盒中自来水颜色清澈；
[0034]Ⅲ)在所述塑料盒中加入AgNO3溶液后，将所述塑料盒放置于摇床上平行摇动8min，然后倒掉染色剂；
[0035]Ⅳ)在所述塑料盒中加入自来水漂洗3次，直至所述塑料盒中自来水颜色清澈后，
倒掉自来水，再用蒸馏水对所述塑料盒漂洗，倒掉蒸馏水；
[0036]Ⅴ
)在所述塑料盒中加入400ml显色剂，将所述塑料盒振动至显影至扩增条带清晰为止；
[0037]Ⅵ
)清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次；
[0038]Ⅶ
)将凝胶放在胶片机上吸干水份，盖上保鲜膜，统计带型，并照相保存。
[0039]进一步地，所述步骤Ⅲ)中AgNO3溶液为0.6g的AgNO3与400ml蒸馏水配置而成。
[0040]进一步地，所述步骤
Ⅴ
)中显色剂为6g的NaOH与400ml水、1ml的甲醛配置而成。
[0041]与现有技术相比，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于评估南荻遗传多样性的SSR分子引物组，其特征在于，所述SSR分子引物组包括26对南荻SSR引物，所述26对南荻SSR引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如表1中SEQ ID No.1～SEQ ID No.52所示。2.一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取不同地域南荻的DNA样本；2)以所述步骤1)中提取的南荻待测样品DNA为模板，对权利要求1所述26对SSR引物PCR扩增，得到扩增产物；3)将所述步骤2)得到的PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，读取电泳数据，统计条带检测结果；4)根据所述步骤3)中条带检测结果，建立二元原始数据矩阵；5)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用PopGen V1.32软件计算每个位点的等位基因数、每个位点的有效等位基因数、Shannon信息指数、多态性条带数、Nei's相似系数、多态性条带百分率遗传多样性参数；6)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用MS
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tools软件计算每个引物的多态信息量和Shannon
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Weaver多样性指数；7)根据所述步骤4)中的二元原始数据矩阵，利用软件NTSYSpc 2.10e对不同地域的南荻计算遗传相似系数；8)根据所述步骤7)中的遗传相似系数，利用SAHN Clustering和非加权法平均聚类法做聚类分析，构建聚类树状图。3.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述建立二元原始数据矩阵的方法为：将所述步骤3)中的条带检测结果进行比对、校正，利用表格工具在相同迁移率位置上无条带出现记为“0”，有扩增条带出现记为“1”。4.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增体系如下：2μl浓度为10pmol/L的模板DNA、6μl2
×
TSINGKE Master Mix、0.24μl浓度为10pmol/L上游引物、0.24μl浓度为10pmol/L下游引物、12μl无菌水。5.根据权利要求2或4所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5min，94℃变性30s，50～68℃退火30s，72℃复性1min，70℃延伸5min；其中，变性、退火和复性循环30次，PCR产物4℃保存。6.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤1)中南荻的样本为南荻幼嫩叶片。7.根据权利要求2所述的一种用于评估南荻遗传多样性的方法，其特征在于，所述步骤1)中提取南荻DNA样本方法包括以下步骤：a)取0.3g叶脉去除的南荻幼嫩叶片，剪碎后置于无菌1...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙茜，廖剑锋，
申请(专利权)人：深圳技术大学，
类型：发明
国别省市：
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