一种基因检测探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基因检测探针及基因检测方法，具体涉及基因检测技术领域，通过采用Turkevich

【技术实现步骤摘要】
一种基因检测探针及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，更具体地说，本专利技术涉及一种基因检测探针及其制备方法。

技术介绍

[0002]DNA的末端标记包括单链DNA51
‑
端和31
‑
端的标记，双链DNA51
‑
凸端、平端和凹端的标记，以及双链DNA3
‑
凸端、平端和凹端的标记。在三种dNTP存在的条件下，利用Klenow酶的DNA聚合酶活性，用[a
‑
32P]dNTP填补31
‑
凹端，或利用其31
→
51外切酶活性和聚合酶活性，以[a
‑
32P]dNTP取代31
‑
平端的末端核苷酸。[a
‑
32P]dNTP的选择取决于DNA 51
‑
端的序列以及实验目的。例如，限制酶Eco RI消化片段的51
‑
凸端为TTAA，应选择能与TT互补结合的[a
‑
32P]dATP；而限制酶BamHI消化片段的51
‑
凸端为CTAG，则应选择能与C互补结合的[a
‑
32P]dGTP。
[0003]3'端标记探针的用途非常广泛，双端标记的DNA片段可作为Southern杂交的分子量标准，凝胶滞后(gel
‑
retardation)试验的探针，凝胶中微量DNA的追踪，以及基因文库筛选或Southern杂交的探针：单端标记的DNA片段可用于化学降解序列测定法的模板，用S1核酸酶进行RNA图谱分析的探针，以及引物延伸反应的引物。另外，Klenow酶催化的末端填补反应还可将生物素、荧光素、地高辛(digoxigenin)等半抗原修饰的核苷酸标记在DNA片段末端。但Klenow酶标记平端DNA的活性不强，高活性平端探针的标记应选用3'
→
5'外切酶活性更强的T4噬菌体DNA聚合酶，针对于上述细胞的研究目前的基因标记探针领域而言，相较于检测手法大多采用单一的荧光标记生物素、荧光素或地高辛等单一的生物素检测方式，亦或者单一的放射性的探针末端标记，以及更为新颖的电化学检测DNA的方法，将纳米金属银标记的寡核苷酸探针与靶基因序列互补杂交后，将DNA上的纳米银用浓硝酸溶解形成Ag
+
离子，然后通过阳极溶出伏安法测定Ag
+
的含量，以达到测定待测DNA的目的，并没有一个能够实现整合的方式使其相互优势能够依据需要进行评定，降低单一测定方式的短板问题。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种基因检测探针及基因检测方法，本专利技术所要解决的技术问题是：目前的检测方式大多检测方法单一，作为不同的检测场景而言，生物素标记有着荧光猝灭的牵制，使其各自检测手段没有一个完备的整合检测方法的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基因检测探针，包括含有生物素、金属Au离子和放射性dATP共同标记的基因检测探针。
[0006]所述基因检测探针包括以下制备方法：
[0007]S1、在100℃下，通过加入还原剂和三价金化合物在质量比100：1的比例下通过Turkevich
‑
Frens法制备10
‑
20nm范围内且分散性较好的AuNPs。
[0008]S2、随即将制取的AuNPs通过加入到有机溶剂中混合搅拌获取混合溶液，将混合溶
液通过离心处理，并去除上层液体，留下沉淀物后干燥获取标记纳米粒子。
[0009]S3、通过将1μg的模板DNA、2.5μL的10
×
EcoRI酶缓冲液、1
‑
2U的EcoRI酶和25μL的去离子水置入试管内，并保持36.5℃进行水浴放置。
[0010]S4、在36.5℃水浴放置1.5
‑
2h后将其水温调节为75℃中，并加入1μL标记纳米粒子、1μL未标记的dNTP、放射性活度为2
‑
10μCi的[a
‑
32P]dATP和1U的KJenow酶孵育15min即可终止。
[0011]S5、然后在试管中加入等体积的Tris平衡酚和氯仿
‑
异戊二醇24：1，剧烈振荡30s，10000r/min离心10min，并将上层水相抽取转移人新的试管中。
[0012]S6、对新试管内部加入等体积氯仿，混匀后10000r/min离心10min，再将上层水相转移人另一试管中。
[0013]S7、在又一试管中加入1/4体积的NaAc，及2倍体积的无水乙醇，在
‑
10～20℃放置10
‑
16h后，12000r/min离心15min并吸出上层清液，再用1℃
‑
5℃的75％乙醇荡洗
[0014]S8、乙醇荡洗后吸出上层清液，挥发干残留的乙醇，然后将沉淀溶于20μL灭菌水中取得被标记的探针。
[0015]S9、将获取的探针通过放到螺口试管内密封并在100摄氏度的水浴中放置5min，再在冰浴中以
‑
1摄氏度温度冷却2min后使用20℃保温柜储存备用即可。
[0016]作为本专利技术的进一步方案：S1中所述还原剂为柠檬酸钠，所述三价金化合物包括氯金酸或氯金酸钠中的一种。
[0017]作为本专利技术的进一步方案：S2中所述有机溶液为地高辛与无水乙醇以0.3:1的比例的混合液，所述S2中离心处理以600g离心力保持5min。
[0018]作为本专利技术的进一步方案：S5中所述的Tris平衡酚pH值为8.0，所述S7中NaAc剂量为4mmol/L。
[0019]作为本专利技术的进一步方案：所述模板DNA采用反应以限制酶Eco RI消化的大肠杆菌DNA片段并对巯基针对于柠檬酸连接为目的修饰的部分片段。
[0020]作为本专利技术的进一步方案：S4中所述的[a
‑
32P]dATP材料采购自amersharm公司的标记脱氧核苷酸。
[0021]作为本专利技术的进一步方案：所述大肠杆菌DNA片段中对巯基针对于柠檬酸连接为目的修饰位于在寡核苷酸的5'端来巯基修饰进而制备硫基化寡核苷酸探针，然后硫基化寡核苷酸探针与纳米金结合，利用SH
‑
和Au表面形成Au
‑
S共价键完成制备。
[0022]本专利技术的有益效果在于：
[0023]本专利技术通过这种方式通过采用Turkevich
‑
Frens法制备表面包裹柠檬酸的AuNPs，同时依据表面继续覆盖部分地高辛有机标识物制取了能够与目标DNA修饰的巯基通过非共价静电作用与柠檬酸实现连接，配合目标DNA表面放射性活度为2
‑
10μCi的标记脱氧核苷酸为基础,制备了集成荧光标记、放射性标记和金属微粒一体的DNA探针。探针粒子内含大量荧光小分子和少量金属离子,金本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因检测探针，其特征在于，用于制造含有生物素、金属Au离子和放射性dATP共同标记的基因检测探针；该制备方法包括以下步骤：S1、在100℃下，通过加入还原剂和三价金化合物在质量比100：1的比例下通过Turkevich
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Frens法制备10
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20nm范围内且分散性较好的AuNPs；S2、随即将制取的AuNPs通过加入到有机溶剂中混合搅拌获取混合溶液，将混合溶液通过离心处理，并去除上层液体，留下沉淀物后干燥获取标记纳米粒子；S3、通过将1μg的模板DNA、2.5μL的10
×
EcoRI酶缓冲液、1
‑
2U的EcoRI酶和25μL的去离子水置入试管内，并保持36.5℃进行水浴放置；S4、在36.5℃水浴放置1.5
‑
2h后将其水温调节为75℃中，并加入1μL标记纳米粒子、1μL未标记的dNTP、放射性活度为2
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10μCi的[a
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32P]dATP和1U的KJenow酶孵育15min即可终止；S5、然后在试管中加入等体积的Tris平衡酚和氯仿
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异戊二醇混合溶液，剧烈振荡30s，10000r/min离心10min，并将上层水相抽取转移人新的试管中；S6、对新试管内部加入等体积氯仿，混匀后10000r/min离心10min，再将上层水相转移人另一试管中；S7、在又一试管中加入1/4体积的NaAc，及2倍体积的无水乙醇，在
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10～20℃放置10
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16h后，12000r/min离心15min并吸出上层清液，再用1℃
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘琳，王红丹，崔存英，
申请(专利权)人：阜外华中心血管病医院，
类型：发明
国别省市：