一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法技术

本发明专利技术提供了一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法。具体包括以下步骤：1)分别构建含有EXO基因的表达载体和含有编码重组蛋白的基因的表达载体，或者构建含有EXO基因和编码重组蛋白的基因的共表达载体；2)转化植物细胞以分泌表达重组蛋白；其中，所述EXO基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码重组蛋白的基因的核酸序列包括编码连接在重组蛋白的N端的分泌型信号肽的核酸序列。本发明专利技术首次发现EXO基因可实现定位于内质网和胞外的重组蛋白的运输，实现重组蛋白的胞外分泌；EXO基因和编码重组蛋白的基因同时转化植物细胞，起到协同作用，提高了重组蛋白的产量和分泌率。提高了重组蛋白的产量和分泌率。提高了重组蛋白的产量和分泌率。

【技术实现步骤摘要】
一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法


[0001]本专利技术涉及DNA重组
，尤其涉及一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法。

技术介绍

[0002]据统计，经美国食品与药品管理局基准上市的新药中，有1/4为重组蛋白药物，到2009年，重组蛋白药物高达151种。目前，临床使用的重组蛋白类药物大多数来自于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达生产平台，少部分来自酵母和昆虫细胞。各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低，但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物细胞表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐。因此，需要一种高表达、经济实用、安全性高的新的表达系统来生产这些重组蛋白。与传统的微生物发酵、动物细胞培养相比，利用植物生物反应器来生产重组蛋白具有表达范围广(5kD
‑
300kD)，表达量高，折叠准确，均一性好，生物活性高，容易储藏，规模化容易，生产成本低，安全无污染等优点。
[0003]但如果重组蛋白在植物细胞中的表达位置定位于胞内，则会带来很多问题。比如增加宿主的代谢负担；或生物活性不佳，导致重组蛋白的有效产率降低，难以保证生物活性。而胞外分泌型表达可较好的解决这一问题。因胞外分泌型表达可提高重组蛋白生物利用度，胞外环境更有利于重组蛋白的稳定性和活性，易于纯化，能够减轻对宿主菌及重组蛋白本身的毒性，并能持续分泌表达。
[0004]但目前对于增加重组蛋白胞外分泌的研究，主要集中于分泌型信号肽的添加。然而，将分泌型信号肽与重组蛋白融合并不能有效地增进重组蛋白分泌，大部分仍停留在细胞内部(Huang等，PLOS ONE.2015,10(10):e0140812)。因此，研发一种可增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，从而获得一种产率高、分泌率高、纯度高、成本低的重组蛋白是急需解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，其解决了现有技术中存在的重组蛋白生产中产率低、分泌率低、产物不易纯化的问题。
[0006]本专利技术一方面，提供一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法：该方法包括以下步骤：
[0007]1)分别构建含有EXO基因的表达载体和含有编码重组蛋白的基因的表达载体，或者构建含有EXO基因和编码重组蛋白的基因的共表达载体；
[0008]2)转化植物细胞以分泌表达重组蛋白；
[0009]其中，所述EXO基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码重组蛋白的基因的核酸序列包括编码连接在重组蛋白N端的分泌型信号肽的核酸序列。
[0010]含有EXO基因的表达载体转化植物细胞后表达EXO因子；含有编码重组蛋白的基因的表达载体转化植物细胞后表达重组蛋白；含有EXO基因和编码重组蛋白的基因的共表达载体转化植物细胞后表达EXO因子和重组蛋白两种蛋白。重组蛋白N端连接的分泌型信号肽可引导合成的重组蛋白通过内质网膜进入内质网内腔，最终被分泌到胞外。
[0011]进一步地，所述分泌型信号肽包括NtPR1a
‑
SSP，所述编码NtPR1a
‑
SSP的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]NtPR1a
‑
SSP可识别内质网膜上的受体，并与之结合，进而引导重组蛋白进入内质网内腔。
[0013]进一步地，所述编码重组蛋白的基因的核酸序列包括编码连接在重组蛋白C端的内质网滞留信号的核酸序列，所述内质网滞留信号包括KDEL或HDEL。
[0014]KDEL是Lys
‑
Asp
‑
Glu
‑
Leu氨基酸残基序列，HDEL是His
‑
Asp
‑
Glu
‑
Leu氨基酸残基序列。当重组蛋白C端加入KDEL或HDEL后，重组蛋白能够被保留在内质网中。
[0015]进一步地，所述编码重组蛋白的基因的核酸序列的5'端连接有非编码区，所述非编码区包括AtCOR47 5'UTR，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]非编码区也可称为非翻译区，为调节元件，用于增强重组蛋白的转录和翻译。
[0017]进一步地，所述EXO基因或编码重组蛋白的基因由启动子驱动，所述启动子包括CaMV 35S启动子、增强型CaMV 35S启动子、NOS启动子、ACTIN启动子。
[0018]进一步地，所述重组蛋白包括细胞因子、抗体、疫苗、酶、血液制品。
[0019]本专利技术的方法通过DNA重组技术适用于制备各种重组蛋白，比如细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等；抗体包括阿达木单抗、赫赛汀抗体、英夫利昔单抗、依那西普、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗等；疫苗包括重组流感病毒疫苗、重组乙型肝炎疫苗、重组新冠病毒疫苗等；酶包括蛋白酶K、淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、脂酶等；血液制品包括血清白蛋白、凝血因子等，上述重组蛋白均适用于本制备方法进行制备。
[0020]本专利技术的一个实施例中，所述重组蛋白为白细胞介素10，所述白细胞介素10的核酸序列为SEQ ID NO.4。
[0021]本专利技术的又一实施例中，所述重组蛋白为赫赛汀抗体，所述赫赛汀抗体的核酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
[0022]进一步地，所述植物细胞包括烟草悬浮细胞、胡萝卜悬浮细胞、拟南芥悬浮细胞。
[0023]本专利技术又一方面，提供一种载体，包括含有EXO基因的表达载体和含有编码重组蛋白的基因的表达载体；或含有EXO基因和编码重组蛋白的基因的共表达载体。
[0024]本专利技术另一方面，提供一种宿主细胞，包括权利要求8所述的载体。
[0025]上述载体转化宿主细胞，能分泌得到重组蛋白。
[0026]本专利技术再一方面，提供上述载体或宿主细胞在制备重组蛋白药物中的应用。
[0027]本专利技术的技术原理为：
[0028]EXO为胞外阳性细胞器EXPO(exocyst positive organelles)的胞外亚基EXO70家族蛋白E2。最初发现，拟南芥EXO的过表达可招募EXPO形成，EXPO将细胞质中的蛋白捕获、包
裹，进而运输、分泌至胞外(比如S
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶2)；但关于EXPO的其他功能尚不明确。经过进一步研究和探索，专利技术人意外发现，将EXO与不同定位的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构建共表达载体，EXO不仅可以输送定位表达在胞质的EGFP，同样可以实现定位表达在内质网与胞外的EGFP的运输；并且专利技术人进一步发现EXO过表达对定位表达在内质网与胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，该方法包括以下步骤：1)分别构建含有EXO基因的表达载体和含有编码重组蛋白的基因的表达载体，或者构建含有EXO基因和编码重组蛋白的基因的共表达载体；2)转化植物细胞以分泌表达重组蛋白；其中，所述EXO基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码重组蛋白的基因的核酸序列包括编码连接在重组蛋白N端的分泌型信号肽的核酸序列。2.如权利要求1所述的一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，其特征在于：所述分泌型信号肽包括NtPR1a
‑
SSP，所述编码NtPR1a
‑
SSP的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，其特征在于：所述编码重组蛋白的基因的核酸序列包括编码连接在重组蛋白C端的内质网滞留信号的核酸序列，所述内质网滞留信号包括KDEL或HDEL。4.如权利要求1所述的一种增加植物细胞重组蛋白胞外分泌的方法，其特征在于：所述编码重组蛋白的基因的核酸序列的5'端连接有非...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪国鹏，相深，杨纬经，
申请(专利权)人：猎境嘉兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：