一种重组人源胶原蛋白及其制备方法技术

本申请涉及一种重组人源胶原蛋白。还提供制备所述的重组人胶原蛋白的方法，本发明专利技术获得一种水溶性好、表达量高、纯度高并能够显著改善伤口愈合情况的人源胶原蛋白。善伤口愈合情况的人源胶原蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源胶原蛋白及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种基因重组人源胶原 蛋白及其编码基因，本专利技术还涉及所述重组人源胶原蛋白的制备 方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白，是一种糖蛋白，根据组织部位、生理功能、分子 结构不同而分为28种以上胶原蛋白，占比最多研究最透彻的为 I型、II型和III型胶原蛋白。人体皮肤内胶原蛋白为I型胶原 和III型胶原，I型胶原主要存在于成人皮肤、肌腱、骨组织，
ꢀⅢ
型胶原主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道，I型胶原和III 型胶原与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。其中，III型 胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成的三股螺旋状，具有优秀的生 物学活性和组织相容性，能促使真皮层成纤维母细胞增生，提高 细胞活性，并被成纤维细胞作为合成胶原蛋白的原料吸收，刺激 细胞更多的合成胶原蛋白、使受损老化的皮肤得到填充和修复， 重建网状结构，增强受损皮肤的扩张力，恢复皮肤弹性。
[0003]然而，天然胶原蛋白的结构复杂，并且无法溶于水，这些特 性限制了天然胶原蛋白的研发、利用和生产。生产胶原蛋白传统 的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、 牛皮、驴皮、鱼等)，从中提取胶原蛋白；另外，还有酶法提取 胶原蛋白；虽然这些方法具有较高的回收率，但是这些方法制取 的胶原蛋白均为长度不等的混合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不 一，难以分离到单独的肽段纯品，同时由于均为异源性胶原蛋白， 在临床上表达出排异反应，使其作为生物医学材料或药物载体等 方面的应用受到了很大限制。此外，上述方法获得的胶原蛋白生 物学活性远远不及人体天然胶原蛋白，不能满足医药、食品和化 妆品等行业需求。
[0004]此外，传统方法获得的胶原蛋白为异种提纯，具备一定的疾 病风险，常见疾病为猪流感、疯牛病、牛流行热等。美国FDA 对动物源性材料或药品带来的疾病风险有严格的管控要求，这对 企业针对相关产品的开发提出了更高的要求。本专利技术的专利技术人正 是基于目前现有技术的缺陷，利用转基因技术和基因重组技术， 在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传 统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲 水性、免疫排异性等。本专利技术正是基于这一思路提出。
[0005]COL21A1基因编码XXI型胶原蛋白的α链，它是 FACIT(具有间断螺旋的原纤维相关胶原蛋白)胶原蛋白家族的 成员。XXI型胶原蛋白定位于含有I型胶原蛋白的组织中，并 保持细胞外基质的完整性。皮肤老化是内源性和外源性因素共同 作用的结果，但整体而言，皮肤出现老化和皮肤中胶原蛋白的含 量和结构关系紧密，年轻皮肤光滑饱满，柔韧弹性的主要原因正 在于真皮层中胶原蛋白充足，弹性纤维处于最佳状态。减缓胶原 蛋白流失&补充胶原蛋白可用于控制和减缓皮肤老化进程，保护 受损皮肤，从而实现美容效果。本专利技术的专利技术人意外获得一种水 溶性好、表达量高、纯度高并能够显著改善伤口愈合情况的人源 胶原蛋白21。
[0006]本专利技术解决的技术问题是提供一种基因重组的人源胶原蛋 白及其编码基因；具
体蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示： YVHHHHHHENLYFQGEDGEVRSSCRTAPTDLVFILDGSYSVG PENFEIVKKWLVQITKNFDIGPKFIQVGVVQYSDYPVLEIPLGS YDSGEHLTAAVESILYLGGNTKTGKAIQFALDYLFAKSSRFLT KIAVVLTDGKSQDDVKDAAQAARDSKITLFAIGVGSETEDAE LRAIANKPSSTYVFYVEDYIAISKIREVMKQKLCEESVCPTRIP VAARDERGFDILLGLDVNKKVKKRIQLSPKKIKGYEVTSKVD LSELTSNVFPEGLPPSYVFVSTQRFKVKKIWDLWRILTIDGRPQ IAVTLNGVDKILLFTTTSVINGSQVVTFANPQVKTLFDEGWHQ IRLLVTEQDVTLYIDDQQIENKPLHPVLGILINGQTQIGKYSGK EETVQFDVQKLRIYCDPEQNNRETACEIPGFNGECLNGPSDV GSTPAPCICPPGKPGLQGPKGDPGLPGNPGYPGQPGQDGKPG YQGIAGTPGVPGSPGIQGARGLPGYKGEPGRDGDKGDRGLP GFPGLHGMPGSKGEMGAKGDKGSPGFYGKKGAKGEKGNA GFPGLPGPAGEPGRHGKDGLMGSPGFKGEAGSPGAPGQDGT RGEPGIPGFPGNRGLMGQKGEIGPPGQQGKKGAPGMPGLMG SNGSPGQPGTPGSKGSKGEPGIQGMPGASGLKGEPGATG
[0007]一方面，本专利技术涉及一种重组人源胶原蛋白，其特征在于氨 基酸序列如SEQ NO.1所示；
[0008]另一方面，本专利技术涉及一种所述蛋白编码基因的载体；
[0009]另一方面，本专利技术涉及所述蛋白编码基因或所述载体的宿主 细胞；
[0010]另一方面，本专利技术涉及所述的重组人源胶原蛋白、所述的载 体、所述的宿主细胞在用于制备化妆品、保健品或药物中的用途；
[0011]另一个方面，本专利技术涉及所述的重组人源胶原蛋白的生产方 法，其特征在于，包括如下步骤：(1)毕赤酵母基因工程菌的构 建；(2)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；(3)重组人源胶原蛋 白的诱导和表达；(4)重组人源胶原蛋白的纯化；
[0012]在一些实施方案中，所述毕赤酵母基因工程菌的构建步骤 为：
[0013](1)活化酵母GS115于YPD平板划线培养；
[0014](2)挑选YPD平板上活化的毕赤酵母GS115的单克隆于 YPD液体中，恒温震荡培养；
[0015](3)移液枪吸取100uL菌液接种在100m LYPD液体中，30℃， 220rpm，12
‑
13h，培养到OD
600
＝1.3
‑
1.5；
[0016](4)镜检观察有无染菌，用无菌的50ml离心管分装菌体， 冰置10
‑
15min；
[0017](5)2次离心，弃上清，用无菌水重悬菌体；
[0018](6)2次离心，弃上清，用山梨醇重悬菌体后分装即为感 受态细胞；
[0019](7)用电转方法将载体转入感受态细胞中，后平板培养至 克隆产生；
[0020]在一些实施方案中，所述毕赤酵母基因工程菌的发酵培养步 骤为：
[0021](1)用挑取YPD板上单菌落于装有50mL BMGY的三角 锥形瓶中，30℃，220rpm培养24h，通过测OD
600
值确认培养 结束；
[0022](2)离心10min，收集菌体，用BMMY清洗一次，再离 心，稀释菌体浓度至OD
600
＝1.0。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO.1所示。2.含有权利要求1所述蛋白编码基因的载体。3.含有权利要求1所述蛋白编码基因或权利要求2所述载体的宿主细胞。4.权利要求1所述的重组人源胶原蛋白、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的宿主细胞在用于制备化妆品、保健品或药物中的用途。5.权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)毕赤酵母基因工程菌的构建；(2)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；(3)重组人源胶原蛋白的诱导和表达；(4)重组人源胶原蛋白的纯化。6.权利要求5所述的方法，所述毕赤酵母基因工程菌的构建步骤为：(1)活化酵母GS115于YPD平板划线培养；(2)挑选YPD平板上活化的毕赤酵母GS115的单克隆于YPD液体中，恒温震荡培养；(3)移液枪吸取100uL菌液接种在100m LYPD液体中，30℃，220rpm，12
‑
13h，培养到OD
600
＝1.3
‑
1.5；(4)镜检观察有无染菌，用无菌的50ml离心管分装菌体，冰置10
‑
15min；(5)2次离心，弃上清，用无菌水重悬菌体；(6)2次离心，弃上清，用山梨醇重悬菌体后分装即为感受态细胞；(7)用电转方法将载体转入感受态细胞中，后平板培养至克隆产生。7.权利要求5或6任一项所述的方法，所述毕赤酵母基因工程菌的发酵培养步骤为：(1)用挑取YPD板上单菌落于装有50mL BMGY的三角锥形瓶中，30℃，220rpm培养24h，通过测OD
600
值确认培养结束；(2)离心10min，收集菌体，用BMMY清洗一次，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇丰，李钧翔，陆益，
申请(专利权)人：禾美生物科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：