用于构建检测染色体拷贝数变异的测序文库的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于构建检测染色体拷贝数变异的测序文库的方法和试剂盒。所述方法包括以下步骤：1）提供基因组DNA或RNA/DNA杂合双链样品；2）向上述样品中加入核酸内切酶和DNA聚合酶，利用切口平移原理将DNA双链或RNA/DNA杂合双链随机打断得到DNA片段并在片段末端加A，以得到加A后的DNA片段；3）将所述加A后的DNA片段与测序接头连接获得连接产物；4）纯化所述连接产物，获得测序文库。所述试剂盒包括：1）随机打切口并进行切口平移和末端加A的试剂；2）将所述加A后的DNA片段与测序接头连接的试剂；和3）用于纯化所述连接产物的试剂。用于纯化所述连接产物的试剂。

【技术实现步骤摘要】
用于构建检测染色体拷贝数变异的测序文库的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及快速构建高通量二代测序文库的方法，具体地，涉及用于构建检测染色体拷贝数变异的测序文库的方法。

技术介绍

[0002]染色体拷贝数变异（CNV）是人类遗传变异的一种重要形式，在人类基因组中广泛分布，其覆盖染色体范围广，突变频率高，可导致突变个体的表型发生严重改变甚至使突变个体死亡。
[0003]目前，检测CNV的技术包括传统核型分析技术（Karyotyping）结合荧光原位杂交（FISH）、染色体微列阵分析技术（Chromosome Microarray Analysis, CMA，如 aCGH 和 SNP
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array）、荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、多重连接探针扩增技术（MLPA）、高通量测序技术（NGS）等（Nord, et al, 2015；Manning and Hudgins, 2010；Trask, 1991；）。近些年日益成熟的NGS因其通量高、准确性高、灵敏性高、自动化程度高和运行成本低等突出的优势，使其在临床研究中得到广泛的应用（Xuan, et al, 2013）。
[0004]在NGS现有的建库技术中，建库的第一步是gDNA片段化，最常见的实现方式是物理打断和酶打断。物理打断法主要包括超声或者声波共聚焦(Covaris)，需要特殊仪器，并且存在用时长，gDNA需要量大，产物回收效率低等问题。酶打断，最常见的是NEB的NEBNext DNA双链片段化酶和Tn5。NEBNext DNA双链片段化酶中的T7核酸内切酶具有专利保护，且片段化后的DNA片段需末端修复和加A过程；Tn5建库成本相对较高，而且必须严格限制DNA投入量和Tn5的比例。
[0005]因此，寻找新型有效的片段化技术和快速的建库方法用于检测染色体拷贝数变异，意义重大。

技术实现思路

[0006]通过基于切口平移法中聚合酶的不同形式提供两种随机打断gDNA的快速建库方法以用于检测染色体拷贝数变异，可以有效解决上述问题。
[0007]根据本专利技术的第一方面，提供用于构建高通量测序文库的方法，包括以下步骤：1）提供基因组DNA或RNA/DNA杂合双链样品；2）向上述样品中加入核酸内切酶和DNA聚合酶，利用切口平移原理将DNA双链或RNA/DNA杂合双链随机打断得到DNA片段并在片段末端加A，以得到加A后的DNA片段；3）将所述加A后的DNA片段与测序接头连接获得连接产物；4）纯化所述连接产物，获得测序文库。
[0008]在一种优选实施方案中，所述核酸内切酶是源自弧菌的核酸内切酶，优选源自嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)(Vvn)的Vvn核酸内切酶。
[0009]在一种优选实施方案中，所述DNA聚合酶是聚合酶单酶或同种类型聚合酶的混合酶，其特点是所述酶具有5
´‑3´
聚合活性和5
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外切活性但不具有3
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外切活性；优选
地，所述DNA聚合酶是Taq DNA Polymerase；优选地，其中步骤2）的反应温度固定，温度范围优选40
‑
65℃，更优选50
‑
60℃。
[0010]在一种优选实施方案中，所述DNA聚合酶是两种类型聚合酶的混合酶，其中一种类型的聚合酶是具有5
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聚合活性以及3
´‑5´
和5
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核酸外切活性；另一种聚合酶是具有5
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聚合活性和5
´‑3´
核酸外切活性但不具有3
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核酸外切活性的聚合酶；优选地，所述DNA聚合酶是DNA Polymerase I和Taq DNA Polymerase的混合酶；优选地，其中步骤2）的反应温度是可变的，先用较低温度反应，再用较高的反应温度反应，其中较低反应温度优选30
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50℃，更优选32
‑
37℃；较高反应温度优选60
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75℃，更优选68
‑
72℃。
[0011]在一种优选实施方案中，其中步骤2）和3）在单一反应管中完成，中间不需要DNA纯化步骤。
[0012]在一种优选实施方案中，所述用于构建高通量测序文库的方法不包含PCR扩增步骤。
[0013]在一种优选实施方案中，其中所述文库用于检测染色体拷贝数变异。
[0014]根据本专利技术的第二方面，提供用于构建高通量测序文库的试剂盒，包括：1）随机打切口并进行切口平移和末端加A的试剂；2）将所述加A后的DNA片段与测序接头连接的试剂；和3）用于纯化所述连接产物的试剂。
[0015]在一种优选实施方案中，所述随机打切口并进行切口平移和末端加A的试剂包括核酸内切酶，DNA聚合酶和dNTP。
[0016]在一种优选实施方案中，所述核酸内切酶是源自弧菌的核酸内切酶，优选源自嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)(Vvn)的Vvn核酸内切酶。
[0017]在一种优选实施方案中，所述DNA聚合酶是聚合酶单酶或同种类型聚合酶的混合酶，其特点是所述酶具有5
´‑3´
聚合活性和5
´‑3´
外切活性但不具有3
´‑5´
外切活性；优选地，所述DNA聚合酶是Taq DNA Polymerase。
[0018]在一种优选实施方案中，所述DNA聚合酶是两种类型聚合酶的混合酶，其中一种类型的聚合酶是具有5
´‑3´
聚合活性以及3
´‑5´
和5
´‑3´
核酸外切活性；另一种聚合酶是具有5
´‑3´
聚合活性和5
´‑3´
核酸外切活性但不具有3
´‑5´
核酸外切活性的聚合酶；优选地，所述DNA聚合酶是DNA Polymerase I 和Taq DNA Polymerase的混合酶。
[0019]在一种优选实施方案中，将所述加A后的DNA片段与测序接头连接的试剂包括连接酶。
[0020]在一种优选实施方案中，所述连接酶是T4 DNA连接酶或者T7 DNA连接酶。
[0021]在一种优选实施方案中，所述用于纯化所述连接产物的试剂选自纯化柱、Qiagen柱、纯化磁珠或者Beckman Ampure XP beads应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本专利技术的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本专利技术的范围。本专利技术的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
[0022]图1：本专利技术所述方法的原理示意图。
[0023]图2：本专利技术所述文库构建方法的示意图。
[0024]图3：确定Vvn核酸内切酶用量胶图，其中gDNA：基因组对照，未进行打断反应；VVn
‑
阴：阴性对照，反应体系中除VVn外，其余反应物均加入进行打断本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于构建高通量测序文库的方法，包括以下步骤：1）提供基因组DNA或RNA/DNA杂合双链样品；2）向上述样品中加入核酸内切酶和DNA聚合酶，利用切口平移原理将DNA双链或RNA/DNA杂合双链随机打断得到DNA片段并在片段末端加A，以得到加A后的DNA片段；3）将所述加A后的DNA片段与测序接头连接获得连接产物；4）纯化所述连接产物，获得测序文库。2.权利要求1所述的方法，其中所述核酸内切酶是源自弧菌的核酸内切酶。3.权利要求1所述的方法，其中所述核酸内切酶是源自嗜盐弧菌的Vvn核酸内切酶。4.权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是聚合酶单酶或同种类型聚合酶的混合酶，其特点是所述酶具有5
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聚合活性和5
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外切活性但不具有3
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外切活性。5.权利要求4所述的方法，其中所述DNA聚合酶是Taq DNA Polymerase。6.权利要求4所述的方法，其中步骤2）的反应温度固定。7.权利要求4所述的方法，其中步骤2）的反应温度为40
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65℃。8.权利要求4所述的方法，其中步骤2）的反应温度为50
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60℃。9.权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是两种类型聚合酶的混合酶，其中一种类型的聚合酶是具有5
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聚合活性以及3
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和5
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核酸外切活性；另一种聚合酶是具有5
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聚合活性和5
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核酸外切活性但不具有3
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核酸外切活性的聚合酶。10.权利要求9所述的方法，其中所述DNA聚合酶是DNA Polymerase I和Taq DNA Polymerase的混合酶。11.权利要求9的所述的方法，其中步骤2）的反应温度是可变的，先用较低温度反应，再用较高的反应温度反应。12.权利要求11所述的方法，其中所述较低反应温度为30
‑
50℃。13.权利要求11所述的方法，其中所述较低反应温度为32
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37℃。14.权利要求11所述的方法，其中所述较高反应温度为60
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75℃。15.权利要求11所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯丽敏，陈迪，张建光，张丽，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：