一种蛋白质亚型分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种对甲胎蛋白及其异质体的稳定同位素双信号协同检测的方法。本发明专利技术的原理是：将作为抗原捕获结构的AFP抗体和磁性微球组装在一起，目标物AFP及其异质体AFP

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质亚型分析方法


[0001]本专利技术属分析化学的检测领域，具体涉及基于生物分子特异性识别的稳定同位素（Metal stable isotope）传感领域，特别设计一种免疫夹心结构，金纳米粒子（AuNPs）与银纳米粒子（AgNPs）产生的稳定同位素通过电感耦合等离子体质谱仪分别对蛋白质及其亚型实现同时检测的方法。

技术介绍

[0002]甲胎蛋白（AFP）是一种肝癌的疾病标志物，但它的敏感性与早期诊断率偏低。实质上AFP是一种糖蛋白，依据与扁豆凝集素（LCA）的亲和力，AFP被分为三种类型：AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其体内的来源也存在差异，其中AFP-L1主要出现在良性的肝脏疾病中如慢性肝炎和肝硬化。AFP-L3只能由癌变的肝细胞产生。临床以AFP-L3占总AFP的比率，简称甲胎蛋白异质体比率（AFP-L3%），2005年美国FDA批准AFP-L3%≥10%，作为诊断肝癌的临界值，并认为是诊断肝癌的高特异性指标。
[0003]在现在建立的对甲胎蛋白异质体的分析方法中，有已经应用于临床的基于LCA亲和的电泳法，传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，但在定量方面具有准确性不足的缺陷。近年来分析化学领域提出的基于表面增强拉曼光谱、电化学的方法，因其操作比传统方法简单、依据的生物原理经典、较好的分析性能和较低的检出限吸引了广泛的研究关注。但在分析方法的准确性、检测信号的稳定性、检测结果的重现性与对血清样本的检测能力方面还需要我们做更多的探索以使对甲胎蛋白异质体比例的检测至臻完善。
[0004]为克服这一制约，本专利技术结合电感耦合等离子体质谱仪（Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICPMS）检出限低（大部分元素都可以达到pg mL-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，将抗体—抗原—纳米粒子标记探针消解后进行稳定同位素检测，在保持优秀的检出限性能同时，实现了对甲胎蛋白与甲胎蛋白异质体的稳定而准确的同时检测，为甲胎蛋白异质体比率的检测提出了一种更稳定可靠的分析方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种基于稳定同位素检测的纳米粒子标记分析方法，以及其在蛋白质与蛋白质亚型检测方面的应用。
[0006]本专利技术的原理是：以甲胎蛋白及其亚型甲胎蛋白异质体为例，在甲胎蛋白与其异质体抗原的存在下，抗甲胎蛋白单克隆抗体可以将其捕获，被捕获固定的抗原继而可以与纳米粒子标记的探针结合。当抗体-抗原-纳米粒子标记探针的夹心结构形成后，探针上的金和银纳米粒子通过酸消解后形成离子，可进行ICPMS定量分析。本专利技术的目的是通过不同浓度的甲胎蛋白及其异质体产生的金与银元素的同位素强度的变化进行线性回归分析，对甲胎蛋白及其异质体进行稳定同位素检测，进而通过同位素强度的比例的关系获得甲胎蛋白异质体比率数值。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术所构建的生物传感器的原理是：利用甲胎蛋白与其异质体的作为抗原的相同点与作为糖蛋白的不不同点设计捕获结构与探针结构。将作为抗原捕获结构的鼠抗人抗甲胎蛋白单克隆抗体和磁性微球（MBs）组装在一起，样品甲胎蛋白及其异质体在缓冲溶液中与捕获抗体进行反应，甲胎蛋白及其异质体均发生抗原抗体特异性结合反应，随后加入4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子探针与扁豆凝集素修饰的银纳米粒子探针，二者分别与甲胎蛋白，甲胎蛋白异质体发生多糖与岩藻糖单元的特异性识别，构成捕获抗体—甲胎蛋白—金纳米粒子探针和捕获抗体—甲胎蛋白异质体—银纳米粒子探针的结构。
[0008]对结合的金与银纳米粒子进行酸消解和稳定同位素检测方法为：磁性分离后，用酸对AuNPs和AgNPs进行消解，形成的金银离子进行ICPMS高灵敏检测。选取197Au与109Ag同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过不同浓度的甲胎蛋白引起的197Au以及甲胎蛋白异质体引起的109Ag同位素强度值进行线性回归分析，即可对待测甲胎蛋白及其异质体进行定量分析；将所对应的同位素197Au与109Ag强度作比值即可得到甲胎蛋白异质体比率；其中，甲胎蛋白及其异质体与抗体反应所用溶液和与金银探针反应的缓冲液均为PBS （10mM，pH=7.4），时间分别为60min和45min，温度为37℃。
[0009]本专利技术有如下有益效果：本专利技术提供了一种可以对甲胎蛋白异质体比率实现一次性双信号检测的分析方法，可以保持在同一样品同时产生准确的分析信号。本专利技术利用的抗体—抗原结构具有目标捕获高效稳定的优势；形成的抗原—探针结构具有选择性好，信号强度高的优势，且磁性分离操作简单，可高通量地对多个样品进行快速而准确的双信号同时分析，从而具有对甲胎蛋白异质体比率响应快速的优势，同时利用ICPMS对稳定同位素检测的检出限低（大部分元素都可以达到pg mL-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，在提高对甲胎蛋白异质体检测的灵敏度的同时，减小了样品使用量与缩短了对一种样品内两种物质的分析时间总和，并具有信号的长时间稳定性，可以实现长时间稳定检测和同时监控。
附图说明
[0010]图1 为本专利技术的实验机理示意图。
[0011]图2 为本专利技术分析方法对AFP以及AFP-L3检测的分析性能示意图。
[0012]图3 为本专利技术分析方法对目标物的选择性结果图。
[0013]图4 为本专利技术分析方法对模拟样品检测结果图。
[0014]图5 为本专利技术分析方法对实际样品检测的分析性能示意图。
[0015]下面结合说明书附图做进一步的说明，但本专利技术分析方法并不限于下述实施例。
[0016]实施例1、实验中，AFP-L3的浓度为0.5 ng mL-1至10 ng mL-1,由图可以看出，在该范围内，AFP-L3浓度与109Ag的ICPMS强度信号（Y）成线性相关关系。线性方程为Y = 24783X + 242161,相关系数R2=0.997,检出限（LOD）为0.1 ng mL-1；AFP的浓度为0.5 ng mL-1至16 ng mL-1,在该范围内，AFP浓度与197Au的ICPMS强度信号（Y）成线性相关关系。线性方程为Y = 12162X + 23425,相关系数R2=0.993,检出限（LOD）为0.2 ng mL-1；本实施例充分证明，本专利技术可以实现对甲胎蛋白及其异质体进行高灵敏的定量分析。
[0017]实施例2、探究本专利技术分析方法对甲胎蛋白及其异质体检测的特异性本实施例利用无机质谱双元素标记的甲胎蛋白及其异质体分析法对几种血清中同样存在或常见的蛋白质进行检测，探究该方法的特异性。我们筛选了人血清中的蛋白质和人血清中的其他广谱肿瘤标志物，以避免基质的干扰。基于免疫分析的特异性识别，只有靶抗原AFP和AFP-L3可以通过免疫反应被磁性微球上的抗AFP抗体捕获，因此AFP或AFP-L3获得的信号强度远高于非靶抗原。人免疫球蛋白G（IgG）、人癌胚抗原（CEA）、人糖类抗原19-9（CA19-9）和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种对蛋白质及其亚型的分析方法，以甲胎蛋白异质体比率为例，其特征是按照以下操作步骤进行。2.a.生物素化的抗体和链霉亲和素修饰的磁性微球的复合a1 取1μL链霉亲和素修饰的磁性微球用200μL 10mM PBS（pH=7.4）于EP管中预洗涤三次，a2 将生物素化的捕获抗体在10mM PBS缓冲溶液（pH=7.4）中在室温下振荡反应30-60min，a3 在磁力架上将反应后的溶液磁性分离，析出上清液，用10mM PBST（pH=7.4）溶液清洗三次。3.b．抗体-磁性微球复合物的位点封闭b1 用1%的牛血清蛋白（BSA）溶液对磁性微球的蛋白位点进行封闭，条件为30min、20-25摄氏度振荡孵育；反应后再次在磁力架上，用10mM PBST（pH=7.4）溶液清洗三次；b2 用5mM的巯基苯硼酸（MBBA）溶液对磁性微球及抗体上的糖位点进行封闭，条件为30min、37摄氏度振荡孵育；反应后再次在磁力架上，用10mM PBST（pH=7.4）溶液清洗三次。4.c．抗原与抗体的免疫反应，c1 取50μL甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和预接抗体的磁性微球进行免疫反应，振荡孵育，时间为60min,温度为37℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘睿，李紫嫣，吕弋，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：